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液相色谱法与液相色谱仪

2017-2-15 阅读(2288)

液相色谱法是20世纪60年代末在经典液相色谱的基础上发展起来的一种现代色谱分析方法,历*曾出现过不同的叫法,如,高压液相色谱(HPLC)、高速液相色谱(HSLC)和高分辨液相色谱(HRLC)。就分离原理而言,HPLC与经典柱层析(色谱)没有本质的区别,但由于采用了高压输液泵、微粒固定相和高灵敏度检测器,HPLC在分析速度、分离效率、检测灵敏度和操作自动化方面,都达到了可与GC相比的程度,并保持了样品适用范围广、流动相种类多和便于制备的柱层析优点,在生物工程、制药工业、食品工业、环境监测和石油化工等领域获得了广泛的应用! HPLC的特点:①样品适用范围广;②分离效率高;③检测灵敏度高;④分析速度快;⑤样品回收方便; 液相色谱法的分类:HPLC的分类方法有多种,比较常见的有三种:(1)按照分离机理分类:①吸附色谱②分配色谱③离子交换色谱(IEC)④体积排阻色谱(SEC)⑤亲和色谱(AC)(2)按照色谱柱洗脱动力学分类:①洗脱法②前沿法③置换法(3) 按照分离目的分类:①分析液相色谱②制备液相色谱 HPLC分析常用的样品处理技术:粉碎、冷冻干燥、气体萃取(顶空分析和吹扫-捕集)、溶剂萃取(回流或索氏萃取,加压溶剂萃取)、固相萃取、固相微萃取、超临界流体萃取、微波萃取、超声波萃取、微透析、衍生化、膜分离、蒸馏、吸附、离心、过滤、浓缩和溶解等。 色谱定性分析方法标准物质对照定性;利用文献数据定性;利用选择性检测器定性;在线联用仪器定性;其它定性方法; 液相色谱仪使用及维护方法液相色谱仪使用时要非常注意!使用卡套柱时,两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗,任何时候都不能将卡套取下来,否则会造成填料的流失。 液相色谱柱使用注意:卡套柱的安装(加预柱):将卡套架套入柱芯将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽,使夹套高于柱芯将已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高过夹套片将“子弹头"预柱放入卡套片内将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧然后依同样的顺序连接好柱子的另一端平衡色谱柱 反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉,因此在用流动相分析样品之前,应使用10~20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱;如果您所使用的流动相中含有缓冲盐,应注意用纯水“过渡"。硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相,请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡如何平衡色谱柱?平衡过程中,将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂度如果较低,则需要较长的时间来平衡)色谱柱的再生。。。进行色谱柱再生时,应使用一个廉价的泵,我们建议不使用您的液相色谱仪上的泵。 注意:在对NH2改性的色谱柱进行再生时,由于NH2可能成铵根离子的形式存在,因此,应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗,然后再用水冲洗至碱溶液*流出。如果简单的有机溶剂/水的处理不能够*洗去硅胶表面吸附的杂质,用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。 液相色谱的常用术语1.色谱曲线(chromatogram):在色谱法中,当样品加入后,样品中各组分随着流动相的不断向前移动而在两相间反复进行溶解、挥发,或吸附、解吸的过程。如果各组分在固定相中的分配系数(表示溶解或吸附的能力)不同,就有可能达到分离。分配系数小的组分滞留在固定相中的时间短,在柱内移动的速度快,先流出柱子;分配系数大的组分滞留在固定相中的时间长,在柱内移动的速度慢,后流出柱子;分离后的各组分经检测器转换成电信号而记录下来,得到一条信号随时间变化的曲线,称为色谱流出曲线或 “色谱峰",理想的色谱流出曲线应该是正态分布曲线。2.(色谱)峰(chromatographic peak):色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。3.峰底(peak base):峰的起点与终点之间的连接的直线。4.峰高(h,peak height):色谱峰zui大值点到峰底的距离。5.峰宽(W ,peak width):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点的距离。6.半高峰宽(Wh/2 ,peak with d at half height):通过峰高的中点作平行于峰底的直线,此直线与峰两侧相交两点之间的距离(图1 中的HJ)。7.峰面积(A ,peak area):峰与峰底之间的面积(图1中的CHEJDC)。8.拖尾峰(tailing peak):后沿较前沿平缓的不对称的峰。9.前伸峰(leading peak):前沿较后沿平缓的不对称的峰。(又叫伸舌峰、前延峰)10.假峰(ghost peak):除组分正常产生的色谱峰外,由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰,即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分,容易给定性、定量带来误差。(又叫鬼峰)11.畸峰(distrorted peak):形状不对称的色谱峰,前伸峰、拖尾峰都属于这类。 12.反峰(negative peak):也称倒峰、负峰,即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。


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