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扩增来自淘洗的噬菌体群落
阅读：1089 发布时间：2011-1-4[器材和试剂]
● 噬菌体缓冲液
● XLl-Blue或者DH5。F，TB细胞
● IPTG（30mg/m1储存液，水溶液；储存在-20℃）
● LB-琼脂培养基+Amp/X-gal/IPTG
● Luria-Bertani（LB） [L-液体培养基（1％细菌用胰蛋白胨，0，5％酵母提取物，0．085m01/LNaCl，pH 7．2）]
● LB+Amp（L-液体培养基，50ug/m1 Amp）
● X-gal（30mg/m1储存液，溶于N，N-二甲基甲酰胺中；暗处储存在一20℃）
● LB-琼脂培养基+Amp/Glu[L-琼脂培养基，50ug/ml Amp，1％葡萄糖]
● 甘油（Sigma）
● M13K07辅助噬菌体（Amersham BioSciences）
● 硫柳汞（Sigma）
[方法]
1．用从磁珠上洗脱下来的已中和噬菌体，感染大约5m1 TB细胞。37℃孵育10分钟， 勿搅动。
2．快速离心以沉淀细菌细胞。去除上清，用1-2m1 LB重悬细胞。将细胞在直径15mm的LB-琼脂培养基+Amp/Glu平板上铺板，37℃下孵育过夜，zui大密度为每板5×103个细胞。
3．次日，用接近10ml的LB牛10％甘油刮取细胞。小量分装并储存在-20℃。
4．在20mlLB+Amp中孵育细胞。调整细胞浓度到OD600≈0．05， 然后剧烈振摇（至少300r/min）培养至光密度OD600≈0．25。
5．在37℃下孵育细胞15分钟，极温和地搅动。
6．用辅助噬菌体M13K07超感染细菌培养物（感染复数moi＝30）。加入IPTG（终浓度为0．1mm01/L），温和搅动10分钟，在37℃下剧烈振摇孵育5小时。
7．以5000r/min 4℃离心细菌/噬菌体悬液30分钟， 回收上清。在LB-琼脂培养基+Amp/X-gal/IPTG平板上，滴定噬菌体上清的TU（通常滴度在l×l010Tu/m1以上）。将噬茵体上清液小量分装，再加入0．05％硫柳汞储存。
8．加入PEG 8000和NaCl溶液（终浓度分别为4％和0，5mol/L）沉淀噬菌体颗粒，然后4℃冰上孵育2～4小时。
9．4℃5000r/min离心40分钟回收噬菌体沉淀，再以原溶液体积的1/10 TBS重悬沉淀。
10，70℃水浴中孵育噬菌体悬液30分钟，使污染的细菌蛋白变性； 以4℃10000r/min离心30分钟去除之。
11．以TU为单位在LB-琼脂培养基+Amp/X-gal/IPTG平板上滴定噬菌体悬液。次轮淘洗需用109- 1011个噬菌体。