b. 限制酶的贮存与取用： 反复解冻与冻结是任何酵素的大忌，因此不可存放于无霜冰箱中。大部份限制酶购买來时即保存在50% glycerol中，存放在 -20℃时不会冻结。 有些限制酶相当不稳定，必须存放在 -70℃，请避免大量购买，也请对你所用的各种限制酶的性质作深入的了解。 自冰箱取出限制酶请立即放入 -20℃冷冻盒或冰浴中，短暂离心 （4℃） 将管壁上或盖上的酵素离心下后再取用。添加不同限制酶必须更换微量移液器头，不可污染。请一次取出需要量，置于微量离心管中，再分别加入各反应中；取用后请立即放回冰箱。

    c. Isoschizomers： 有些不同的限制酶可以作用在相同的DNA 序列上，这些酵素互称为isoschizomers。 例如︰SstI 与SacI；HincII 与HindII；EspI 与Bpu1102I。相关的资料均可由工具书或各厂商目录查到。

    d. 限制酶的反应条件： 每一厂商生产的限制酶均附有zui适用的10 倍浓度反应液 （10×Rx Buf），但必须注意，同一种限制酶若來自不同厂商，其Rx Buf及反应温度可能不同，故使用前请务必参考其說明书或厂商目录，厂商目录中都会表列出各种限制酶在不同Rx Buf反应效率。 使用两种以上的限制酶进行切割时，可依照该表选择适当的Rx Buf，并遵循以下几点原则：

    1. 若各种限制酶所用的Rx Buf 相同，则可同时加入反应液中，但须注意glycerol 的zui终浓度不可超过10%，有些酵素对glycerol 浓度的限制更严格，不可超过5%。

    2. 若各种限制酶所用的Rx Buf不同，但差異仅在盐的浓度时，可先加入需盐浓度较低者，反应*后直接加入NaCl, KCl, MgCl2 等调整盐浓度，再加入第二种酵素。

    3. 若各种限制酶所用的Rx Buf *不同时，则以任一种酵素作用*后，先经drop dialysis 更换溶液或以酒精沉淀DNA 后，再以另一种酵素作用。

    e. 限制酶使用量与反应时间： 一单位的限制酶活性通常定义为，在zui适反应温度与条件下，能使1 μg 基质DNA 在1 h 被切割*所需的酵素量。通常可加入较多量的酵素或把反应时间加长，但有些酵素不稳定，反应时间加长并不具意义。加入的酵素量需考虑甘油的zui终浓度。以避免甘油浓度太高造成对酵素活性的抑制或改变其作用。

    f. 中止反应： 一般限制酶可以65℃加热15 min中止反应，但有些酵素具热安定性，则可加入EDTA （zui终浓度为10 mM） 或以phenol处理。

    g. 限制酶无法作用时：当样品DNA 无法被切割时，请努力回想或检查：

    1. DNA 是否含有高盐？

    2. DNA 是否含有杂质？

    3. Phenol 或酒精是否去除干净？

    4. 酵素是否贮存不当而失去活性？

    5. 酵素量或Rx Buf 是否加入过多？

    6. 反应温度太高或太低？

    7. 酵素是否无法作用methylated DNA？