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火箭免疫电泳法测定补体C4、B因子

阅读:824          发布时间:2012-3-3

1.主要试剂
(1)羊抗人C4抗血清:按说明书所示单扩效价扩大2—4倍稀释,或分别用含不同浓度抗体的琼脂糖凝胶浇板,选择峰高、清晰度适当的抗体浓度为zui适工作浓度。
(2)羊抗人B因子抗血清:按说明书所示单扩效价扩大3—5倍稀释,也可按选择C4抗血清稀释浓度的方法确定zui适工作浓度。
(3)电泳缓冲液:称取10.30g巴比妥钠,1.83g巴比妥,溶于1 000mL蒸馏水中。此液为pH8.6,离子强度0.05的巴比妥缓冲液。
(4)凝胶缓冲液:以定量测定时用1:4稀释的电泳缓冲液,B因子定量时1:5稀释。
(5)染色液:0.25%考马斯亮蓝,称取0.25g考马斯亮蓝R-250,溶于100mL脱色液中。
(6)脱色液:甲醇900mL、冰醋酸200mL、蒸馏水900mL。

2.操作步骤
(1)1%琼脂糖凝胶板的制备:称取0.50g琼脂糖和1z聚乙二醇(PEG 6 000)置100mL三角烧瓶中,加入50mL凝胶缓冲液,隔水煮沸至琼脂糖*溶解,55℃保温;加入适量的抗C4血清或抗B因子血清(预先实验选定)混匀,浇板,凝胶厚度lmm。沿阴约2cm处打孔,孔间距6~8mm,孔径3—3.5mm。
(2)待测样本用凝胶缓冲液1:10稀释,参考血清对倍稀释(一般作5个稀释度),每孔加5~IOul。
(3)将样本孔端接负极,电压12。5V/cra电泳5ho
(4)取出凝胶板,用生理盐水漂洗2次,去离子水漂洗1次。
(5)将干净滤纸铺在凝胶板上,干燥、常规染色、脱色。
(6)结果计算:量取各火箭峰的高度,根据峰高—浓度标准曲线计算待测样本中C4或Bf含量。

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