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抗体捕捉生物测定法检测IL—12
阅读:500 发布时间:2012-5-5IL-12由B细胞产生,由分子量分别为35kD和40kD两个亚基通过二硫键连接而成,其功能为诱导T细胞、NK细胞产生IFN-7;增强T细胞、NK细胞的细胞毒作用,促进激活的T细胞、NK细胞增殖。
利用鼠抗人IL-12McAb(可自Roche公司购得)测IL-12浓度。
1.用包被缓冲液(pH9.5的碳酸钠缓冲液)稀释包被抗体为15ug/mL,在96孔酶标反应板,每孔加100rtl,室温包被过夜。
2.洗涤后加封闭液(含1%BSA的磷酸盐缓冲液)每孑L 2001uL,37℃1h。
3.在试管中稀释IL-12标准品为1ng/mL,然后作5倍系列稀释至8pe/mL(3管)。
4.待测样品用*培养液作5倍系列稀释3—5个稀释度。
5.酶标板洗涤后,分别加各稀释度Ibl2标准品及待检标本,每孔100uL,每一标本设3复孔,加100~L*培养液,室温孵育2.5—3ho
6.洗5次后,加PHA激活的人淋巴母细胞悬液(终浓度为2X104/mL)100uL/孔,C02温箱培养24h。
7.加3H-TdR,以下步骤同IL-2测定。根据标准曲线计算IL-12水平。
8.注意事项 应尽量使待测样品孔的3H-TdR掺人率位于标准曲线的陡峭部分,这样所得结果才准确。此外,由于IL-12分泌细胞中有40kD多肽的过量表达,而40kD多肽无IL-12的生物活性,故并非所有的抗IL-12抗体均适用于本法。