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再生式序列复制反应直接扩增RNA靶序列
阅读:806 发布时间:2012-6-30再生式序列复制反应(self-sustained sequence replication reaction,3SR)是一项与PCR类似的新技术。它利用3种酶(AMV逆转录酶、RNA酶H及T7RNA聚合酶)的活性,进行体外mRNA的扩增。
所用的引物A与待检的RNA3’端互补,并在引物的5’端含一个T7RNA聚合酶的识别结合位点;引物B则与引物A引导合成的cDNA的3’端互补。3SR的基本原理是,在AMV逆转录酶的作用下,以靶mRNA为模板,在引物A的引导下合成cDNA*链,形成RNA/DNA杂交体。而RNA酶H则可破坏RNA/DNA杂交体中的模板RNA。
AMV逆转录酶同时还具有DNA聚合酶活性,此时以cDNA*链为模板,在引物B的引导下合成cDNA第二链,形成双链cDNA。此cDNA的*链上带有T7RNA聚合酶启动子,在T7RNA聚合酶的作用下,即可合成与靶mRNA序列相同的RNA。新合成的RNA又可作为模板进入下一次循环,如此,以RNA/DNA和双链cDNA为中间体,通过逆转录和转录反应的反复循环将靶mRNA扩增。
3SR反应产物以10的指数递增,其扩增效率比PCR高,而反应时间明显缩短,仅需15min。3SR是能将RNA靶序列直接扩增出来的一项十分有效的新技术。