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放射受体测定法测定转化生长因子TGFβ
阅读:506 发布时间:2012-7-281.培养上清中TGF-β的激活 测定前必须使无血清培养上清中TGF-β激活。激活有热激活和酸激活两种方法,热激活法是通过将标本加热至80℃5min而激活。酸激活法的步骤如下:
①在200uL无血清培养上清中加6mol/LHCl 1.5ul,使pH≤3.0,22℃孵育30rain;
②用30ul中缓冲液中和,调至pH7.0~7.4。若pH值不在此范围,可加少量1:10稀释的6mol/LHCl或中和缓冲液调整(中和缓冲液为6mol/LNaOH和1mol/LHEPES等量混合而成);
③用于胸腺细胞增殖法测定前,标本用RPMI-1640稀释4倍。
2.在24孔培养板中加A549细胞1.7X105/孔,在*DMEM培养液中培养18~24h,以形成A549细胞单层,用结合缓冲液(含0.1%BSA的磷酸盐缓冲液)洗涤1次。
3.在培养板的前四排中,用结合缓冲液对重组或纯化TGF-p进行系列稀释,浓度范围为1—1 000pmol/L,每孔200gL,用于绘制TGF-p的标准曲线;后两排中,加系列稀释的酸激活待测上清,200uL/孔。
4.将培养板置于22℃振荡2h,用冷结合缓冲液洗3次,每孔加200/uL 50pmol/L125I-TGF-β,22℃孵育2h。
5.同上洗2次后,加600~L解离缓冲液,22℃作用20min,使细胞解离。解离缓冲液的配方为:20mmol/LHEPES、2%TritonX-100和10%甘油。
6.从每孔取500uL,用r计数仪测定放射活性。
7.通过测定外标记TGF-β过量时(10nmol/L)的细胞放射活性,估计非