精品啪啪一级免费视频 丙酮酸激酶试剂盒说明书

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一、 测定意义

丙酮酸激酶酶催化糖酵解过程中的zui后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一， 也是动植物组织中产生 ATP 的关键酶之一，因此测定动植物组织中 PK 的活性具有重要意 义。

二、 测定原理

在二磷酸腺昔（ADP）存在的条件下丙酮酸激酶能够催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转化 成丙酮酸，丙酮酸与 2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在碱性溶液中显棕 红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比，由此计算丙酮酸激酶活力。 三、试验中所需的仪器和设备

可见分光光度计或酶标仪、37℃恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃 比色皿或酶标板、蒸馏水

四、试剂的组成和配制

试剂一：粉剂×1 瓶，常温保存，用时加入 50mL 双蒸水溶解，4℃保存 3 个月； 试剂二：液体 13 mL×1 瓶，4℃保存 3 个月；

试剂三：粉剂×1 支，常温保存；用时加 1mL 双蒸水充分溶解; 试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存；用时加 1.2 mL 双蒸水充分溶解； 试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；用时加 550μL 双蒸水充分溶解； 试剂六：2 mmol/L 标准液母液 1mL，-20  ℃保存 1 个月； 试剂七：储备液 15 mL，4℃避光保存 3 个月；

试剂八：终止试剂 50 mL，4℃保存 3 个月；

五、粗酶液的提取

准确称取组织重量，按重量体积比（g/mL）加 9 倍试剂一，制成 10%匀浆。8000 g/min

离心 10 min，取上清液待测，同时测定组织蛋白含量。

六、测定步骤

取试剂二 11.4mL，试剂三 0.69mL，试剂四 1.2mL 加入混合液试剂瓶中，该试剂

瓶中含有 1.71mL 液体，配成总体积为 15mL 的混合液（该混合液配好后 4℃保 存 1 个月），按下表进行操作。

充分混匀，37℃水浴 15 分钟

充分混匀，37℃水浴 15 分钟

充分混匀，静置 3 分钟，450 nm 下测定吸光度

注意：

1. 以上反应体系用 1 mL 玻璃比色皿测定，若需要用酶标仪测定，将反应体系中各试剂组

成缩小 5 倍即可。

2. 粗酶液的提取必须在 0℃ - 4℃中操做完成，以防止酶变性失活。

3. 测定过程中所有试剂必须在冰上放置。

七、动植物组织中 PK 活力单位的计算：

丙酮酸标准曲线制作：

将 2 mmol/L 的丙酮酸标准品用双蒸水分别稀释成 1 mmol/L、0.8 mmol/L、0.6 mmol/L、 0.4 mmol/L、0.2 mmol/L 溶液，按照测定操作表中标准孔体系测定不同浓度的丙酮酸标准品 的吸光值。 

计算标准曲线公式为 y = 0.4667χ - 0.0013（χ 为丙酮酸浓度，mmol/L； y 为吸光值） 推出：χ = （y + 0.0013）÷0.4667（χ 为丙酮酸浓度，mmol/L； y 为吸光值）

单位定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1 nmol 丙酮酸定义为一个活力单位。