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3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)生化检测试剂盒测定步骤

阅读:284          发布时间:2024-3-6

3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)生化检测试剂盒 测定步骤:


1、分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。


2、将试剂二在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min以上。


3、操作表:



试剂名称(μL)


测定孔


样本


20


试剂二


760


试剂三


10


试剂四


10




将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中,混匀后立即在340 nm波长下记录初始吸光度A1和反应1min后的吸光度A2,计算ΔA=A1-A2。


注意:若A1-A2大于0.5,需将样本用提取液稀释,使A1-A2小于0.5,可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。


NAD-MDH活力单位的计算:


1、血清(浆)NAD-MDH活力的计算


单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。


NAD-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=6430×ΔA


2、组织、细菌或细胞中NAD-MDH活力的计算:


(1)按样本蛋白浓度计算:


单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。


NAD-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr


(2)按样本鲜重计算:


单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。


NAD-MDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T =6430×ΔA÷W


(3)按细菌或细胞密度计算:


单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。


NAD-MDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V样÷V样总)÷T=3.215×ΔA


V反总:反应体系总体积,8×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;2000:细胞或细菌总数,2000万。


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