猴子 α 1 微球蛋白（α 1-MG ） elisa 试剂盒 说明书

elisa 试剂盒常见组成部分：

1 ）酶和底物：在 ELISA 中 zui 常用的酶为 HRP 和 ALP 。

2 ）抗体：在 ELISA 中应用的抗体可分为多克隆抗体 ( 多抗 ) 和单克隆抗体 ( 单抗 ) 。

3 ）抗原：在 ELISA 中应用的抗原要求有较高的特异性、亲和力和纯度。主要有三类，即自然抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。

4 人 E 选择素 (E-Selectin/CD62E) 检测试剂盒包被：将免疫活性物质 ( 抗原或抗体 ) 结合于固相载体上的过程称为包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纤维薄膜等；常用的方法有吸附法、化学交联法及亲和素 - 生物素间接包被法

5 ）固相载体：固相载体是 ELISA 中用以分离结合标记物和游离标记物的主要手段，应与各种免疫活性物质有良好的结合性能并且不改变其免疫活性。常用的固相载体有聚苯乙烯塑料和硝酸纤维素膜。

样本实验前准备：

ELISA 试剂盒液体样本：包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。

（ 1 ）血清

室温血液自然凝固 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

（ 2 ）血浆：

应根据标本的要求选择 EDTA 、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

（ 3 ）尿液：

用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

（ 4 ）细胞培养上清：

检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。

（ 5 ）培养细胞

检测细胞内的成份时，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

（ 6 ）组织标本

切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS ， PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8 ℃的温度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ），或组织蛋白萃取试剂 , 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

操作步骤

1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在 di 一、第二孔中分别加标准品 100 μ l ，然后在 di 一、第二孔中加标准品稀释液 50 μ l ，混匀；然后从 di 一孔、第二孔中各取 100 μ l 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50 μ l ，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50 μ l 弃掉，再各取 50 μ l 分别取 50 μ l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50 μ l ，混匀后从第七、第八孔中加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul ，混匀；混匀后从第五、第六孔中各分别取 50 μ l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50 μ l ，混匀后从第九第十孔中各取 50 μ l 弃掉。（稀释后各孔加样量都为 50 μ l ，浓度分别为 180 ng/L ， 120 ng/L ， 60 ng/L ， 30 ng/ ， 15 ng/L ）。

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40 μ l ，然后再加待测样品 10 μ l （样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置 37 ℃温育 30 分钟。

4. 配液：将 30 （ 48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 （ 48T 的 20 倍）倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50 μ l ，空白孔除外。

7. 温育：操作同 3 。

8. 洗涤：操作同 5 。

9. 显色：每孔先加入显色剂 A50 μ l ，再加入显色剂 B50 μ l ，轻轻震荡混匀， 37 ℃避光显色 15 分钟 .

10. 终止：每孔加终止液 50 μ l ，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零， 450nm 波长依序测量各孔的吸光度（ OD 值）。 测定应在加终止液后 15 分钟。

注意事项

1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5. 底物请避光保存。

6. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准 .

7. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

8. 本试剂不同批号组分不得混用。

9. 如需代测或者样本暂时不测定，可立即低温冻存，温度越低越好，中间避免反复冻融， -20 ℃以下可保存三个月 ,-70 ℃以下可保存六个月。

10. 试剂使用须知：

11. （ 1 ）请参照相关法规、文献、 MSDS 等信息，理解并掌握好试剂的特性，再进行安全操作。

12. （ 2 ）通常购买试剂时一定要想到一次性用完。若估算不足有剩余的话，更加注意其他保管和管理。

13. （ 3 ）万一试剂操作者并非专业技术人员。必须在专业人士的指导监督下进行操作。对于使用后的废弃物，不要或者旧的试剂，应按照相关法律法规正当处理。

14. （ 4 ）购买后，请务必确认标签上的注意事项；做好预防颠倒，摔坏的措施和管理体制；在使用前再次确认标签上的注意事项，做好必要的安全对策；对没有标明其危害特性、有害特性的，也要慎重地进行操作；必须带好防护用具，小心翼翼进行操作。