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猴子α1微球蛋白(α1-MG)elisa试剂盒实验原理
阅读:113 发布时间:2023-6-26提 供 商 | 上海谷研实业有限公司 | 资料大小 | 13.2KB |
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资料类型 | WORD 文档 | 浏览次数 | 113次 |
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猴子 α 1 微球蛋白(α 1-MG ) elisa 试剂盒 说明书
elisa 试剂盒常见组成部分:
1 )酶和底物:在 ELISA 中 zui 常用的酶为 HRP 和 ALP 。
2 )抗体:在 ELISA 中应用的抗体可分为多克隆抗体 ( 多抗 ) 和单克隆抗体 ( 单抗 ) 。
3 )抗原:在 ELISA 中应用的抗原要求有较高的特异性、亲和力和纯度。主要有三类,即自然抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。
4 人 E 选择素 (E-Selectin/CD62E) 检测试剂盒包被:将免疫活性物质 ( 抗原或抗体 ) 结合于固相载体上的过程称为包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纤维薄膜等;常用的方法有吸附法、化学交联法及亲和素 - 生物素间接包被法
5 )固相载体:固相载体是 ELISA 中用以分离结合标记物和游离标记物的主要手段,应与各种免疫活性物质有良好的结合性能并且不改变其免疫活性。常用的固相载体有聚苯乙烯塑料和硝酸纤维素膜。
样本实验前准备:
ELISA 试剂盒液体样本:包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。
( 1 )血清
室温血液自然凝固 10-20 分钟后,离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
( 2 )血浆:
应根据标本的要求选择 EDTA 、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,混合 10-20 分钟后,离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
( 3 )尿液:
用无菌管收集。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。
( 4 )细胞培养上清:
检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。
( 5 )培养细胞
检测细胞内的成份时,用 PBS ( PH7.2-7.4 )稀释细胞悬液,细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
( 6 )组织标本
切割标本后,称取重量。加入一定量的 PBS , PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8 ℃的温度。加入一定量的 PBS ( PH7.4 ),或组织蛋白萃取试剂 , 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。
操作步骤
1. 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔 10 孔,在 di 一、第二孔中分别加标准品 100 μ l ,然后在 di 一、第二孔中加标准品稀释液 50 μ l ,混匀;然后从 di 一孔、第二孔中各取 100 μ l 分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50 μ l ,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取 50 μ l 弃掉,再各取 50 μ l 分别取 50 μ l 分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50 μ l ,混匀后从第七、第八孔中加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul ,混匀;混匀后从第五、第六孔中各分别取 50 μ l 加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50 μ l ,混匀后从第九第十孔中各取 50 μ l 弃掉。(稀释后各孔加样量都为 50 μ l ,浓度分别为 180 ng/L , 120 ng/L , 60 ng/L , 30 ng/ , 15 ng/L )。
2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40 μ l ,然后再加待测样品 10 μ l (样品最终稀释度为 5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
3. 温育:用封板膜封板后置 37 ℃温育 30 分钟。
4. 配液:将 30 ( 48T 的 20 倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 ( 48T 的 20 倍)倍稀释后备用。
5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置 30 秒后弃去,如此重复 5 次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶标试剂 50 μ l ,空白孔除外。
7. 温育:操作同 3 。
8. 洗涤:操作同 5 。
9. 显色:每孔先加入显色剂 A50 μ l ,再加入显色剂 B50 μ l ,轻轻震荡混匀, 37 ℃避光显色 15 分钟 .
10. 终止:每孔加终止液 50 μ l ,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11. 测定:以空白空调零, 450nm 波长依序测量各孔的吸光度( OD 值)。 测定应在加终止液后 15 分钟。
注意事项
1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间好控制在 5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
5. 底物请避光保存。
6. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准 .
7. 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
8. 本试剂不同批号组分不得混用。
9. 如需代测或者样本暂时不测定,可立即低温冻存,温度越低越好,中间避免反复冻融, -20 ℃以下可保存三个月 ,-70 ℃以下可保存六个月。
10. 试剂使用须知:
11. ( 1 )请参照相关法规、文献、 MSDS 等信息,理解并掌握好试剂的特性,再进行安全操作。
12. ( 2 )通常购买试剂时一定要想到一次性用完。若估算不足有剩余的话,更加注意其他保管和管理。
13. ( 3 )万一试剂操作者并非专业技术人员。必须在专业人士的指导监督下进行操作。对于使用后的废弃物,不要或者旧的试剂,应按照相关法律法规正当处理。
14. ( 4 )购买后,请务必确认标签上的注意事项;做好预防颠倒,摔坏的措施和管理体制;在使用前再次确认标签上的注意事项,做好必要的安全对策;对没有标明其危害特性、有害特性的,也要慎重地进行操作;必须带好防护用具,小心翼翼进行操作。