荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物，受到紫外光或蓝紫光照射时，可激发成为激发态，当从激发态恢复基态时，发出荧光。荧光标记技术指利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记的无放射物污染，操作简便等优点，使得荧光标记物在许多研究领域的应用日趋广泛。

  荧光标记物质在蛋白的功能研究、药物筛选等领域也有着广泛的应用。人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发（例如，各种激酶、磷酸酶、肽酶等）。荧光标记是非常常用的实验方法。一般来讲，荧光标记染色的目的有3个：

1、多种蛋白标记后，分析蛋白在空间上的分布特征；

2、免疫荧光标记后进行蛋白半定量分析，分析蛋白半定量表达量；

3、标记细胞核，以便分析细胞核数量，如凋亡细胞计数等。

上方所述的第1条和第3条是荧光标记染色的最佳应用场景，一般并不推荐将荧光标记应用于第2条。如果一定要在荧光图像上进行蛋白半定量分析呢？其实也是有一个测量标准，即测量灰度。

1、灰度的概念应用
与WB蛋白条带分析原理一致，免疫荧光分析也是围绕灰度进行分析。不同的荧光强度本质上可以理解成灰度值的差异，因为在分析时，我们是在同一通道下进行比较的。举个例子，大家都是红色的，只是红色的强度和分布面积不同，这个强度可以灰度来代替。再细化一下灰度概念，我们测量图像时，是为了得到积分灰度值或者平均灰度值。积分灰度值即图像上目标区域所有像素点的灰度值之和，可以代表目标区域所包含蛋白的总相对表达量。
平均灰度值即目标区域积分灰度值除以目标区域面积，可以代表目标区域的平均蛋白表达量。
个人认为平均灰度值是更适合的测量指标，因为它有积分灰度值和面积这两个指标的约束，相较于积分灰度值来说更靠近客观事实。

2、通道分割
最简dan 的免疫荧光标记是DAPI（蓝）+单通道荧光（红或绿）。如下

这种是最普通的荧光标记，图像上只有2个通道激发光。在分析之前，必须将2个通道的荧光分割开，获得2张图像。其实这就是荧光图像merge的反向操作。
无论是image J或者是Image Pro Plus软件，都内置通道分割的功能。因此，实施起来还是很简单的。
同理，多色荧光标记其实就是多了通道而已，分割方法也是一样的。

3. 荧光强度转换为灰度
无论是JPEG格式还是TIFF格式的荧光图像，都是32bit RGB图，但是灰度图是8bit 黑白图像。
因此，在进行灰度分析之前，必须对原始彩色图像进行格式转换，最终得到8bit 黑白图像。常做蛋白条带分析的人肯定清楚，分析之前，先对原始图像去色，然后再转换成8bit 黑白图。荧光图像的灰度分析，也是这么个道理。

4、测量
测量是很简单的。原理是在一定的分割阈值下，选择测量参数为Area、Mean gray value这两个测量指标。
值得一提的是，分割阈值。阈值8bit 黑白图像中很重要的一个参数，它的大小直接决定了目标区域的面积和灰度值。其功能类似于彩色图像中的γ值。
有经验的朋友知道，通过调整γ值可以调整整个图像的特征；同一张图在不同的γ值下，甚至可能变成两个wan 全不同的图像。
所以，在进行测量时，分割阈值是非常值得仔细斟酌的测量条件。