实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通过对PCR扩增反应中的每一个循环产物荧光信号的实时监测从而实现对起始模板的定性及定量分析。

1.在qPCR 技术中重要的参数指标有哪些？

 扩增及溶解曲线：扩增曲线是PCR过程中，以循环数为横坐标，以荧光强度为纵坐标所绘制的曲线。主要用于反映qPCR的动态进程；溶解曲线是用来验证扩增产物特异性的，如果产物是单一条带，溶解曲线就会出现单峰，如果有引物二聚体或其它非特异性扩增，就会出现至少两个峰。

荧光域值（threshold）: 是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍，即：threshold。

  Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。将已知浓度的标准品梯度稀释进行qPCR，按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。Ct值与起始模板数的对数值之间存在线性关系，可以制作标准曲线。未知浓度的样品也得到Ct值，代入标准曲线，就可以求出未知样品的起始模板量。

2.扩增曲线一般分为哪几个阶段：

  荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。在qPCR扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期，

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的，随着反应循环数的增加，zui终PCR反应不再以指数形式生成模板，从而进入平台期，在该时期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，只有在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。

3.ROX染料的作用

ROX（Passive Reference Dye）是一种惰性参比染料，在qPCR反应中能被qPCR仪检测到。ROX不参与qPCR反应，荧光信号值不会随着qPCR扩增而改变。实验过程中很多因素会引起孔间差异：不均匀的照明，孔与孔之间光学因素（液滴、气泡）的因素，反应体系的浓度不同…… 可以用ROX作为阳性参比，对其他荧光信号进行归一化校正，以提高数据的较精确度。

4.Ct值多少才算理想

一般来说Ct值在30以下都可以说实验结果是可靠的，30以上基本可以说明该基因没有扩增，但也不是的，需要辅以溶解曲线加以解释。