人高迁移率族蛋白B1(HMGB-1）elisa 试剂 盒

人高迁移率族蛋白B1(HMGB-1） elisa 试剂盒 实验原理

人高迁移率族蛋白B1(HMGB-1） 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。 往预先包 被 人高迁移率族蛋白B1(HMGB-1） 捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并*洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的 人高迁移率族蛋白B1(HMGB-1） 呈 正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样本处理及要求

1. 血清 ： 将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4 ℃ 过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20 ℃ 或-80 ℃ 保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆 ： 用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8 ℃  1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 ℃ 或-80 ℃ 保存，但应避免反复冻融。
3.  组织匀浆： 用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.  细胞培养物上清或其它生物标本： 请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

需要而未提供的试剂盒器材

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

人高迁移率族蛋白B1(HMGB-1） ELISA 试剂盒 组成

名称	96孔配置	48孔配置	备注
微孔酶标板	8 孔× 12 条	8 孔× 6 条	无
标准品	0. 3 mL*6管	0. 3 mL*6管	无
样本稀释液	6mL	3mL	无
检测抗体-HRP	10mL	5mL	无
20×洗涤缓冲液	25mL	15mL	按说明书进行稀释
底物A	6mL	3mL	无
底物B	6mL	3mL	无
终止液	6mL	3mL	无
封板膜	2张	2张	无
说明书	1份	1份	无
自封袋	1个	1个	无

备 注 ：

1. 标准品浓度依次为 ：

2. 经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50 μL 样本上样即可。当有部分样本值超过大标准品浓度时，可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。

注意事项

1、 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2、 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3、 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4、 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5、 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6、 在储存和温育时避免强光直接照射。

7、 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8、 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9、 不能使用过期产品。

10、 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置 。

试剂准备

试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

2 0×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

操作步骤

1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3. 样本孔 中 加 入 待测样本 5 0μL；空白孔不加。

4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液 （350 μL ） ，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以 所测标准品的OD值 为横坐标， 标准品的浓度 值为纵坐标，在坐标纸上 或用相关软件绘制 标准曲线 ，并得到 直线回归方程 ， 将样品的OD值代入方程，计算出样品 的 浓度 。

试剂盒性能

1、检测范围：

2、 灵敏度：低检测浓度小于 10 pg/mL 。

3、 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4、 重复性：板内变异系数小于 10 %  ， 板间变异系数小于1 5 % 。