小鼠干细胞因子/肥大细胞生长因子(SCF/MGF）elisa试剂盒课题研究课题研究

小鼠干细胞因子/肥大细胞生长因子(SCF/MGF）elisa试剂盒实验原理

小鼠干细胞因子/肥大细胞生长因子(SCF/MGF） ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被小鼠干细胞因子/肥大细胞生长因子(SCF/MGF）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠干细胞因子/肥大细胞生长因子(SCF/MGF）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样本处理及要求

1. 血清： 将收集于血清分离管的全血标本在室温放置 2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆： 用 EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆： 用预冷的 PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清或其它生物标本： 请 1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

需要而未提供的试剂盒器材

1.酶标仪（ 450nm ）

2.高精度加样器及枪头： 0.5-10uL 、 2-20uL 、 20-200uL 、 200-1000uL

3. 37℃ 恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

名称	96 孔配置	48 孔配置	备注
微孔酶标板	8 孔 × 12 条	8 孔 × 6 条	无
标准品	0. 3 mL*6 管	0. 3 mL*6 管	无
样本稀释液	6mL	3mL	无
检测抗体 -HRP	10mL	5mL	无
20× 洗涤缓冲液	25mL	15mL	按说明书进行稀释
底物 A	6mL	3mL	无
底物 B	6mL	3mL	无
终止液	6mL	3mL	无
封板膜	2 张	2 张	无
说明书	1 份	1 份	无
自封袋	1 个	1 个	无

备注 ：

1、标准品浓度依次为：详见说明书；

2、经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50 μL 样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时，可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。

注意事项

1、严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温 20-25℃ 。使用后立即冷藏保存试剂。

2、洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3、消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。

4、底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5、避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6、在储存和温育时避免强光直接照射。

7、平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8、任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9、不能使用过期产品。

10、如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

试剂准备

试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

2 0× 洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1 ： 20 稀释，即 1 份 20× 洗涤缓冲液加 19 份蒸馏水。

操作步骤

1.从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4℃ 。

2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL ；

3.样本孔中加入待测样本5 0μL ；空白孔不加。

4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（ HRP ）标记的检测抗体 100μL ，用封板膜封住反应孔， 37℃ 水浴锅或恒温箱温育 60min 。

5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（ 350 μL ），静置 1min ，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物 A 、 B 各 50μL ， 37℃ 避光孵育 15min 。

7.每孔加入终止液 50μL ， 15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。

实验结果计算

以所测标准品的 OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的 OD 值代入方程，计算出样品的浓度。

试剂盒性能

1、检测范围：详见产品说明书。

2、灵敏度： 详情见说明书 。

3、特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4、重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。