牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒（实时荧光PCR法）如何操作

【产品名称】

通用名称： 牛结节性皮肤病病毒 检测试剂盒（实时荧光PCR法）

英文名称 ： L umpy skin disease virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】  25 T /盒＆ 50 T /盒

【预期用途】

本试剂盒利用实时荧光PCR原理，定性检测 LSDV ，对 LSDV 引起的 牛 的疫病的诊断和监控具有重要指导意义。

【检验原理】

本试剂盒针对LSDV高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含 LSDV 基因组模板的情况下， PCR 反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对 PCR 过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。

【主要组成成份】

注：阴性对照为 灭菌纯水 ，阳性对照为 含 牛结节性皮肤病 靶基因的质粒 。

【储存条件及有效期】 避光-20 ℃ 以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。

【适用仪器】 ABI 系列、 Bio-Rad 系列、 Agilent Stratagene MX 系列、 Roche LightCycler 480 、 西安天隆系列 、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。

【样本要求】

1.　样品采集及处理

1.1 患畜液体 样品：无菌采集抗凝血或血清、精液或细胞悬浮液5 mL。

1.2 患畜组织 样品： 包括皮肤、肺、脾脏、淋巴结、肌肉 等组织样品。2~8℃低温运输至实验室用于检测。

2.　样品处理方法

2.1　组织样品： 包括皮肤、肺、脾脏、淋巴结、肌肉等。取2g-5g组织样品切成小块，加入 5ml-10ml 预冷的 PBS 缓冲液匀浆 2min ，制成悬液，反复冻融 3 次， 4℃ 5000r/m 离心 10min ，取上清液待检；

2.2　液体样品：抗凝血样品置离心管中，掌上离心机离心 2 分钟取上层血浆，待检。非抗凝血样品置离心管中，待凝固后，掌上离心机离心 2 分钟取上层血清，待检。

2.3标本收集后若不能立即检测，可置于 2 ～ 8℃ 冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于 -20℃ ～ -80℃ ；

标本保存期间应避免反复冻融。

【检验方法】

1. 试剂准备（试剂准备区）

（1）从冰箱中取出试剂盒 , 从试剂盒中取出实验所需试剂，充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。

（2）核算当次实验所需要的反应数（ n ），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。

n =阴性对照数（ 1T ） + 阳性对照数（ 1T ） + 误差预留量（ 1T ） + 样本数

（ 3 ）在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至 PCR 反应管。

（ 4 ）盖紧PCR反应管盖后将 PCR 反应管转移至样本处理区。剩余试剂放回 -20 ℃ 以下冰箱冷冻保存。

2.样本准备（样本处理区）

用QIAGEN、 Roche 公司 DNA 提取试剂盒提取 DNA ，具体操作按照其试剂盒说明书操作。

3.加样

在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本 DNA 各 5μl 、终体积 25μl/ 管，盖好 PCR 反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到 PCR 仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加 5μL 试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为 25μl/ 管，盖好 PCR 反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到 PCR 仪器上。

4. PCR（PCR扩增区）

（1）取样本处理区准备好的 PCR 反应管，放置在实时荧光定量 PCR 仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。

（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行 PCR 扩增。

注：ABI系列荧光 PCR 仪在设置时不选 ROX 校正，设置淬灭基团选择 None 。

【参考值（参考范围）】

1.试剂盒有效性判定：

（1）阳性对照：有典型 S 型扩增曲线或 Ct 值 ≤35 。

（2）阴性对照： Ct 值＞ 38 或无 Ct 值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。

2.标本结果判定：

（1） 阳性：标本检测结果Ct值 ≤35 或有明显指数增长期。

（2）可疑： 标本检测结果Ct值在 35 ～ 38 范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果 Ct 值仍在 35 ～ 38 范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。

（3）阴性：标本检测结果 Ct 值＞ 38 或无 Ct 值。

【检验结果的解释】

【检验方法的局限性】

1. 当检测样本中被检核酸浓度含量低于本试剂盒的 最 di 检出 限 shi 可能会发生假阴性的结果。

2. 本试剂盒仅供标本初步筛查使用，对于本试剂盒检测阳性结果应进一步使用培养法进行确诊。

【产品性能指标】 产品的 最 di 检出限为10 ³ Copies/mL ，产品CV值 ≤ 3 %。

【注意事项】

1. 使用本试剂盒的实验室，应严格按照国家有关部分颁布的有关基因扩增检验实验室管理规范进行管理 ；

2. 为避免RNA降解，样本处理过程应在 0-4℃ 条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理 ；

3. 各区域物品均为专用，不得交叉使用，以免污染 ； 检测结束后，应立即对工作台清洁 ；

4. 吸取反应液时，应尽量避免产生气泡 ； 上 PCR 仪前，应注意检查各反应管是否盖紧，以免液体蒸发造成结果不准确 ；

5. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离 心；

6. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在第一次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放 ；

7. 为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在 PCR 反应管上进行任何标记 ；

8. 检测过程中使用过的吸头，应直接打到盛有 10% 次氯酸的废物缸内，检测结束的 PCR 反应管，切忌开盖，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃 ； 工作台及各种实验用品应定期用 10% 次氯酸、 75% 酒精或紫外灯进行消毒 ；

9. 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置； 不同批号试剂不能混用 ； 并在有效期内使用 。