口蹄疫病毒 A 型 PCR 检测试剂盒操作说明书

【产品名称】

通用名 称： 口蹄疫病毒 A 型 PCR 检测试剂盒 （实时荧光PCR法）

英文名称 ： Foot and Mouth Disease Virus （ s ero type A ） Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】 2 5 T /盒 & 50 T /盒

【预期用途】

口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus， FMDV)属于 小RNA病毒科 ，口蹄疫病毒属，主要侵害 偶蹄兽 ， 有O、 A 、 C 、 SAT1 、 SAT2 、 SAT3 和 Asia-I 七个血清型。口蹄疫发病 以发热、口腔黏膜及蹄部和乳房皮肤发生水泡和溃烂为特征，是国际兽疫局规定的A类传染病，易通过空气传播，传染性强，流行迅速，偶尔感染人 。 由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的 “ 头号杀手 " 。

本试剂盒利用实时荧光 PCR 原理，定性检测口蹄疫 A 型病毒（ FMDV - A) ，对 FMDV-A 引起的偶蹄兽类病的诊断和监控具有重要指导意义。

【检验原理】

本试剂盒针对 口蹄疫病毒 A 型 的高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含 口蹄疫病毒 A 型 基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量 PCR 仪对 PCR 过程中相应通道信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。

【主要组成成份】

注：阴性对照为 偶蹄 兽类 基因组DNA，阳性对照为失去活性的 FMDV-A病毒 cDNA。

【储存条件及有效期】 避光-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期 12 个月。

【适用仪器】 ABI 系列、 Bio-Rad 系列、 Agilent Stratagene MX 系列 、 Roche LightCycler R480 、 Cepheid SmartCycler 、 Rotor-Gene 系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量 PCR 仪。

【样本要求】

1. 新鲜采集的咽拭子、疱疹液和粪便标本，并使用灭菌生理盐水悬浮。

2. 应避免标本间交叉污染。

3. 标本收集后 可立即检测； 若不 能立即 检测， 可置于 2 ～ 8 ℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应 冻存于- 8 0℃ 以下，避免反复冻融。

【检验方法】

1. 试剂准备（试剂准备区）

（1）从冰箱中取出试剂盒 , 从试剂盒中取出实验所需试剂 ， 充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。

（2）核算当次实验所需要的反应数（ n ），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。

n =阴性对照数（ 1T ） + 阳性对照数（ 1T ） + 误差预留量（ 1T ） + 样本数

( 3 ) 在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至 PCR 反应管。

2.样本准备（样本处理区）

用QIAGEN、 Roche 公司 RNA 提取试剂盒提取 RNA ，具体操作按照其试剂盒说明书操作。

3.加样

在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本 RNA 各 5 μl 、终体积 25 μl/ 管，盖好 PCR 反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到 PCR 仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加 5 μL 试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为 25 μl/ 管，盖好 PCR 反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到 PCR 仪器上。

4. PCR（ PCR 扩增区）

（1）取样本处理区准备好的 PCR 反应管，放置在实时荧光定量 PCR 仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。

（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行 PCR 扩增。

注：ABI系列荧光 PCR 仪在设置时不选 ROX 校正，设置淬灭基团选择 None 。

【参考值（参考范围）】

1.试剂盒有效性判定：

（1）阳性对照：有典型 S 型扩增曲线或 Ct 值 ≤35 。

（2）阴性对照： Ct 值＞ 38 或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。

2.标本结果判定：

（1） 阳性：标本检测结果Ct值 ≤35 或有明显指数增长期。

（2）可疑： 标本检测结果Ct值在 35 ～ 38 范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在 35 ～ 38 范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。

（3）阴性：标本检测结果 Ct 值＞ 38 或无Ct值。

【检验结果的解释】

【检验方法的局限性】

1. 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的 最 di 检出 限 shi 可能会发生假阴性的结果。

2. 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。

3. 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染，则容易得到假阳性结果。

【产品性能指标】 产品的 最 di 检出限为10 ²  Copies/mL，产品 CV 值 ≤5% 。

【注意事项】

1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作，各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。

2. 为避免RNA降解，样本处理过程应在 0-4℃ 条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。

3. 每次实验应该设置阴、阳性对照。

4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。

5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在 di 一次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。

6. 为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在 PCR 反应管上进行任何标记。

7. 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置； 不同批号试剂不能混用。

8. ABI系列荧光定量 PCR 仪参数设置中不选 ROX 校正，淬灭基因选择 None 。

9. 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。