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口蹄疫病毒A型PCR检测试剂盒操作说明书
阅读:196 发布时间:2025-4-16口蹄疫病毒 A 型 PCR 检测试剂盒操作说明书
【产品名称】
通用名 称: 口蹄疫病毒 A 型 PCR 检测试剂盒 (实时荧光PCR法)
英文名称 : Foot and Mouth Disease Virus ( s ero type A ) Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】 2 5 T /盒 & 50 T /盒
【预期用途】
口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)属于 小RNA病毒科 ,口蹄疫病毒属,主要侵害 偶蹄兽 , 有O、 A 、 C 、 SAT1 、 SAT2 、 SAT3 和 Asia-I 七个血清型。口蹄疫发病 以发热、口腔黏膜及蹄部和乳房皮肤发生水泡和溃烂为特征,是国际兽疫局规定的A类传染病,易通过空气传播,传染性强,流行迅速,偶尔感染人 。 由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少,被称为畜牧业的 “ 头号杀手 " 。
本试剂盒利用实时荧光 PCR 原理,定性检测口蹄疫 A 型病毒( FMDV - A) ,对 FMDV-A 引起的偶蹄兽类病的诊断和监控具有重要指导意义。
【检验原理】
本试剂盒针对 口蹄疫病毒 A 型 的高度保守区域设计特异性引物和探针,在反应体系中含 口蹄疫病毒 A 型 基因组模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量 PCR 仪对 PCR 过程中相应通道信号进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。
【主要组成成份】
序号 |
组成 |
25 T /盒 |
50 T /盒 |
1 |
FMDV -A RT-PCR反应液 |
375 μL×1管 |
750 μL×1管 |
2 |
FMDV -A 逆转录酶 |
50 μL×1管 |
100 μL×1管 |
3 |
FMDV -A Taq酶 |
75 μL×1管 |
150 μL×1管 |
4 |
FMDV -A 阳性对照 |
40 μL×1管 |
40 μL×1管 |
5 |
FMDV -A 阴性对照 |
40 μL×1管 |
40 μL×1管 |
6 |
说明书 |
1份 |
1份 |
注:阴性对照为 偶蹄 兽类 基因组DNA,阳性对照为失去活性的 FMDV-A病毒 cDNA。
【储存条件及有效期】 避光-20℃以下保存,避免反复冻融,有效期 12 个月。
【适用仪器】 ABI 系列、 Bio-Rad 系列、 Agilent Stratagene MX 系列 、 Roche LightCycler R480 、 Cepheid SmartCycler 、 Rotor-Gene 系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量 PCR 仪。
【样本要求】
1. 新鲜采集的咽拭子、疱疹液和粪便标本,并使用灭菌生理盐水悬浮。
2. 应避免标本间交叉污染。
3. 标本收集后 可立即检测; 若不 能立即 检测, 可置于 2 ~ 8 ℃冷藏过夜保存;如需长期保存,标本应 冻存于- 8 0℃ 以下,避免反复冻融。
【检验方法】
1. 试剂准备(试剂准备区)
(1)从冰箱中取出试剂盒 , 从试剂盒中取出实验所需试剂 , 充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
(2)核算当次实验所需要的反应数( n ),并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
n =阴性对照数( 1T ) + 阳性对照数( 1T ) + 误差预留量( 1T ) + 样本数
单反液配制表(每份 ) |
RT-PCR反应液 |
15.0 μL |
逆转录酶 |
2.0 μL |
|
Taq酶 |
3.0 μL |
( 3 ) 在无菌离心管中加入上述试剂,充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至 PCR 反应管。
2.样本准备(样本处理区)
用QIAGEN、 Roche 公司 RNA 提取试剂盒提取 RNA ,具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3.加样
在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本 RNA 各 5 μl 、终体积 25 μl/ 管,盖好 PCR 反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到 PCR 仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加 5 μL 试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品,终体积为 25 μl/ 管,盖好 PCR 反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到 PCR 仪器上。
4. PCR( PCR 扩增区)
(1)取样本处理区准备好的 PCR 反应管,放置在实时荧光定量 PCR 仪样品槽相应位置,并记录放置顺序。
(2)按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行 PCR 扩增。
反应体积 |
25 μL |
通道选择 |
FAM 通道采集 FMDV-A病毒荧光信号 |
PCR 反应 条件 |
步骤 |
条件 |
循环数 |
反转录 |
42℃: 10 分钟( min ) |
1 |
|
预变性 |
95℃: 3 分钟( min ) |
1 |
|
预扩增 |
95℃: 5 秒( s ) |
5 |
|
55℃: 40 秒( s ) |
|||
PCR扩增 |
95℃: 5 秒( s ) |
4 0 |
|
55℃: 40 秒( s ) (此阶段结束时采集荧光信号) |
注:ABI系列荧光 PCR 仪在设置时不选 ROX 校正,设置淬灭基团选择 None 。
【参考值(参考范围)】
1.试剂盒有效性判定:
(1)阳性对照:有典型 S 型扩增曲线或 Ct 值 ≤35 。
(2)阴性对照: Ct 值> 38 或无Ct值,线形为直线或轻微斜线,无指数增长期。
2.标本结果判定:
(1) 阳性:标本检测结果Ct值 ≤35 或有明显指数增长期。
(2)可疑: 标本检测结果Ct值在 35 ~ 38 范围内。此时应对标本进行重复检测,如重复实验结果Ct值仍在 35 ~ 38 范围内,有明显指数增长期,则判定为阳性,否则为阴性。
(3)阴性:标本检测结果 Ct 值> 38 或无Ct值。
【检验结果的解释】
【检验方法的局限性】
1. 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的 最 di 检出 限 shi 可能会发生假阴性的结果。
2. 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。
3. 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染,则容易得到假阳性结果。
【产品性能指标】 产品的 最 di 检出限为10 2 Copies/mL,产品 CV 值 ≤5% 。
【注意事项】
1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作,各区实验服、仪器、耗材应独立使用,不能混用;实验用吸头采用带滤芯吸头;样本处理区应配有生物安全柜,样本处理在生物安全柜中进行操作;三个区应该配有紫外线杀菌装置。
2. 为避免RNA降解,样本处理过程应在 0-4℃ 条件下操作,且完成实验后立即上机检测;样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。
3. 每次实验应该设置阴、阳性对照。
4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀,并应瞬时离心。
5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在 di 一次使用前应全部转移至标本准备区,并单独存放。
6. 为防止荧光干扰,应避免裸手直接接触PCR反应管,并应避免在 PCR 反应管上进行任何标记。
7. 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置; 不同批号试剂不能混用。
8. ABI系列荧光定量 PCR 仪参数设置中不选 ROX 校正,淬灭基因选择 None 。
9. 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。