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口蹄疫病毒A型PCR检测试剂盒操作说明书

阅读:196          发布时间:2025-4-16

口蹄疫病毒 A PCR 检测试剂盒操作说明书

【产品名称】

通用名 称: 口蹄疫病毒 A PCR 检测试剂盒 (实时荧光PCR法)

英文名称 Foot and Mouth Disease Virus s ero type A Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】 2 5 T / & 50 T /

【预期用途】

口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus FMDV)属于 RNA病毒科 ,口蹄疫病毒属,主要侵害 偶蹄兽 O A C SAT1 SAT2 SAT3 Asia-I 七个血清型。口蹄疫发病 以发热、口腔黏膜及蹄部和乳房皮肤发生水泡和溃烂为特征,是国际兽疫局规定的A类传染病,易通过空气传播,传染性强,流行迅速,偶尔感染人 由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少,被称为畜牧业的 头号杀手 "

本试剂盒利用实时荧光 PCR 原理,定性检测口蹄疫 A 型病毒( FMDV - A) ,对 FMDV-A 引起的偶蹄兽类病的诊断和监控具有重要指导意义。

【检验原理】

本试剂盒针对 口蹄疫病毒 A 的高度保守区域设计特异性引物和探针,在反应体系中含 口蹄疫病毒 A 基因组模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量 PCR 仪对 PCR 过程中相应通道信号进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。

【主要组成成份】

序号

组成

25 T /

50 T /

1

FMDV -A  RT-PCR反应液

375 μL×1

750 μL×1

2

FMDV -A 逆转录酶

 50 μL×1

100 μL×1

3

FMDV -A  Taq

 75 μL×1

150 μL×1

4

FMDV -A 阳性对照

 40 μL×1

 40 μL×1

5

FMDV -A 阴性对照

 40 μL×1

 40 μL×1

6

说明书

1

1

注:阴性对照为 偶蹄 兽类 基因组DNA,阳性对照为失去活性的 FMDV-A病毒 cDNA

【储存条件及有效期】 避光-20℃以下保存,避免反复冻融,有效期 12 个月。

【适用仪器】 ABI 系列、 Bio-Rad 系列、 Agilent Stratagene MX 系列 、 Roche LightCycler R480 Cepheid SmartCycler Rotor-Gene 系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量 PCR 仪。

【样本要求】

1. 新鲜采集的咽拭子、疱疹液和粪便标本,并使用灭菌生理盐水悬浮。

2. 应避免标本间交叉污染。

3. 标本收集后 可立即检测; 若不 能立即 检测, 可置于 2 8 ℃冷藏过夜保存;如需长期保存,标本应 冻存于- 8 0℃ 以下,避免反复冻融。

【检验方法】

1. 试剂准备(试剂准备区)

1)从冰箱中取出试剂盒 , 从试剂盒中取出实验所需试剂 充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。

2)核算当次实验所需要的反应数( n ),并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。

n =阴性对照数( 1T + 阳性对照数( 1T + 误差预留量( 1T + 样本数

单反液配制表(每份 )

RT-PCR反应液

15.0 μL

逆转录酶

 2.0 μL

Taq

 3.0 μL

( 3 ) 在无菌离心管中加入上述试剂,充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至 PCR 反应管。

2.样本准备(样本处理区)

QIAGEN Roche 公司 RNA 提取试剂盒提取 RNA ,具体操作按照其试剂盒说明书操作。

3.加样

在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本 RNA 5 μl 、终体积 25 μl/ 管,盖好 PCR 反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到 PCR 仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加 5 μL 试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品,终体积为 25 μl/ 管,盖好 PCR 反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到 PCR 仪器上。

4. PCR PCR 扩增区)

1)取样本处理区准备好的 PCR 反应管,放置在实时荧光定量 PCR 仪样品槽相应位置,并记录放置顺序。

2)按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行 PCR 扩增。


反应体积

25 μL

通道选择

FAM 通道采集 FMDV-A病毒荧光信号

PCR

反应

条件

步骤

条件

循环数

反转录

    42℃ 10 分钟( min

1

预变性

95℃ 3 分钟( min

1

预扩增

95℃ 5 秒( s

5

55℃ 40 秒( s

PCR扩增

95℃ 5 秒( s

4 0

55℃ 40 秒( s

(此阶段结束时采集荧光信号)

注:ABI系列荧光 PCR 仪在设置时不选 ROX 校正,设置淬灭基团选择 None

【参考值(参考范围)】

1.试剂盒有效性判定:

1)阳性对照:有典型 S 型扩增曲线或 Ct ≤35

2)阴性对照: Ct 值> 38 或无Ct值,线形为直线或轻微斜线,无指数增长期。

2.标本结果判定:

1 阳性:标本检测结果Ct ≤35 或有明显指数增长期。

2)可疑: 标本检测结果Ct值在 35 38 范围内。此时应对标本进行重复检测,如重复实验结果Ct值仍在 35 38 范围内,有明显指数增长期,则判定为阳性,否则为阴性。

3)阴性:标本检测结果 Ct 值> 38 或无Ct值。

【检验结果的解释】

通道及检测结果

标本检测结果解释

FAM

阳性(+)

标本中检出FMDV-A病毒 RNA

阴性(-)

标本中未检出FMDV-A病毒 RNA

【检验方法的局限性】

1. 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的 di 检出 shi 可能会发生假阴性的结果。

2. 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。

3. 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染,则容易得到假阳性结果。

【产品性能指标】 产品的 di 检出限为10 2  Copies/mL,产品 CV ≤5%

【注意事项】

1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作,各区实验服、仪器、耗材应独立使用,不能混用;实验用吸头采用带滤芯吸头;样本处理区应配有生物安全柜,样本处理在生物安全柜中进行操作;三个区应该配有紫外线杀菌装置。

2. 为避免RNA降解,样本处理过程应在 0-4℃ 条件下操作,且完成实验后立即上机检测;样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。

3. 每次实验应该设置阴、阳性对照。

4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀,并应瞬时离心。

5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在 di 一次使用前应全部转移至标本准备区,并单独存放。

6. 为防止荧光干扰,应避免裸手直接接触PCR反应管,并应避免在 PCR 反应管上进行任何标记。

7. 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置; 不同批号试剂不能混用。

8. ABI系列荧光定量 PCR 仪参数设置中不选 ROX 校正,淬灭基因选择 None

9. 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。


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