化工仪器网
技术文章
猪细小病毒检测试剂盒（实时荧光PCR法）操作细节
阅读：221 发布时间：2025-4-18
猪细小病毒 检测试剂盒（实时荧光PCR法）操作细节 病毒
【产品名称】
通用名 称： 猪细小病毒 检测试剂盒（实时荧光PCR法）
英文名称 ： Porcine pamovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】 2 5 T /盒 & 50 T /盒
【预期用途】
本试剂盒利用 实时荧光 PCR 原理， 定性检测 猪细小病毒 ，对 猪细小病毒 引起的 疾病 诊断及疗效评估有重要指导意义。
【检验原理】
本试剂盒针对 猪细小病毒 的高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含 猪细小病毒 基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量 PCR 仪对 PCR 过程中相应通道信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
【主要组成成份】
|
序号 |
组成 |
25 T /盒 |
50 T /盒 |
|
1 |
PPV RT-PCR反应液 |
437.5 μL×1 管 |
875 μL×1 管 |
|
2 |
PPV 混合酶液 |
50 μL×1管 |
100 μL×1管 |
|
3 |
PPV 阳性对照 |
40 μL×1管 |
40 μL×1管 |
|
4 |
PPV 阴性对照 |
40 μL×1管 |
40 μL×1管 |
|
5 |
说明书 |
1份 |
1份 |
注：阴性对照为 猪 基因组DNA，阳性对照为 经灭活处理的猪细小病毒核酸提取物 。
【储存条件及有效期】 避光-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期 12 个月。
【适用仪器】 ABI 系列、 Bio-Rad 系列、 Agilent Stratagene MX 系列 、 Roche LightCycler R480 、 Cepheid SmartCycler 、 Rotor-Gene 系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量 PCR 仪。
【样本要求】
1.70 日龄以内流产胎儿、死胎、木乃伊胎及弱仔的脑、肾、 睾丸、肠系膜淋巴 结或母猪的胎盘、阴道分泌物和精液均可作为检测病毒的材料。以肠系膜淋巴结和肝脏检出率最高。
2. 血液或血清样品：使用无菌注射液抽取样品置于离心管中待检。
3. 肌肉或内脏样品：取少量样品（ 2 ～ 3 克）于研钵或匀浆器中研磨，然后将研磨匀浆转入无菌离心管中， 3000 rpm 离心 10 分钟取上清待检。
4. 应避免标本间交叉污染。
5. 标本收集后 可立即检测； 若不 能立即 检测， 可置于 2 ～ 8 ℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应 冻存 于 - 8 0 ℃ 以下，避免反复冻融。
【检验方法】
1. 试剂准备（试剂准备区）
（1）从冰箱中取出试剂盒 , 从试剂盒中取出实验所需试剂 ， 充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
（2）核算当次实验所需要的反应数（ n ），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
n =阴性对照数（ 1T ） + 阳性对照数（ 1T ） + 误差预留量（ 1T ） + 样本数
|
单反液配制表(每份 ) |
RT-PCR反应液 |
17.5 μL |
|
混合酶液 |
2.5 μL |
( 3 ) 在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至 PCR 反应管。
2.样本准备（样本处理区）
用QIAGEN、 Roche 公司 病毒 提取试剂盒提取 DNA ，具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3.加样
在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本 RNA 各 5 μl 、终体积 25 μl/ 管，盖好 PCR 反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到 PCR 仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加 5 μL 试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为 25 μl/ 管，盖好 PCR 反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到 PCR 仪器上。
4. PCR（ PCR 扩增区）
（1）取样本处理区准备好的 PCR 反应管，放置在实时荧光定量 PCR 仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行 PCR 扩增。
|
反应体积 |
25 μL |
通道选择 |
FAM 通道采集 猪细小病毒 荧光信号 |
|
PCR 反应 条件 |
步骤 |
条件 |
循环数 |
|
UNG 酶 |
50 ℃ ： 2 分钟（min） |
1 |
|
|
预变性 |
95℃： 3 分钟（ min ） |
1 |
|
|
预扩增 |
95℃： 5 秒（ s ） |
5 |
|
|
55℃： 40 秒（ s ） |
|||
|
PCR扩增 |
95℃： 5 秒（ s ） |
4 0 |
|
|
55℃： 40 秒（ s ） （此阶段结束时采集荧光信号） |
注：ABI系列荧光 PCR 仪在设置时不选 ROX 校正，设置淬灭基团选择 None 。
【参考值（参考范围）】
1.试剂盒有效性判定：
（1）阳性对照：有典型 S 型扩增曲线或 Ct 值 ≤35 。
（2）阴性对照： Ct 值＞ 38 或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。
2.标本结果判定：
（1） 阳性：标本检测结果Ct值 ≤35 或有明显指数增长期。
（2）可疑： 标本检测结果Ct值在 35 ～ 38 范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在 35 ～ 38 范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。
（3）阴性：标本检测结果 Ct 值＞ 38 或无Ct值。
【检验结果的解释】
【检验方法的局限性】
1. 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的 最 di 检出 限 shi 可能会发生假阴性的结果。
2. 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。
3. 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染，则容易得到假阳性结果。
【产品性能指标】 产品的 最 di 检出限为10 2 Copies/mL，产品 CV 值 ≤5% 。
【注意事项】
1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作，各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。
2. 为避免RNA降解，样本处理过程应在 0-4℃ 条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。
3. 每次实验应该设置阴、阳性对照。
4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。
5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在第一次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。
6. 为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在 PCR 反应管上进行任何标记。
7. 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置； 不同批号试剂不能混用。
8. ABI系列荧光定量 PCR 仪参数设置中不选 ROX 校正，淬灭基因选择 None 。
9. 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。