资料下载
猪流行性腹泻病毒PCR检测试剂盒说明书
阅读:1082 发布时间:2019-4-8猪流行性腹泻病毒 PCR 检测试剂盒
【产品名称】
通用名 称: 猪流行性腹泻病毒 PCR 检测试剂盒 (实时荧光PCR法)
英文名称 : Porcine epidemic diarrhea virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】 2 5 T /盒 & 50 T /盒
【预期用途】
本试剂盒利用实时荧光 PCR 原理,定性检测猪流行性腹泻病毒,对猪流行性腹泻病毒引起的疾病诊断及疗效评估有重要指导意义。
【检验原理】
本试剂盒针对 猪流行性腹泻病毒 的高度保守区域设计特异性引物和探针,在反应体系中含 猪流行性腹泻病毒 基因组模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。
【主要组成成份】
序号 |
组成 |
25 T /盒 |
50 T /盒 |
1 |
PEDV RT-PCR反应液 |
375 μL×1管 |
750 μL×1管 |
2 |
PEDV 逆转录酶 |
50 μL×1管 |
100 μL×1管 |
3 |
PEDV Taq酶 |
75 μL×1管 |
150 μL×1管 |
4 |
PEDV 阳性对照 |
40 μL×1管 |
40 μL×1管 |
5 |
PEDV 阴性对照 |
40 μL×1管 |
40 μL×1管 |
6 |
说明书 |
1份 |
1份 |
注:阴性对照为 猪 基因组DNA,阳性对照为失去活性的 猪流行性腹泻病毒 cDN A 。
【储存条件及有效期】 避光-20℃以下保存,避免反复冻融,有效期 12 个月。
【适用仪器】 ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。
【样本要求】
1. 适用标本类型:发病动物血液、空肠及小肠肠内容物及组织脏器 ( 肠道组织、肠系膜及淋巴结等 ) 和病毒培养液。
2. 标本采集,方法如下:
(1) 血清:用一次性注射器取静脉血 2-3ml ,转至 5ml 的干燥管中,密闭送检。
(2) 肠内容物:无菌条件下取肠道内容物约 1g 左右,置入 1ml 含有 1.0ml PBS( 或生理盐水 ) 的 5ml 离心管中,立即送检。
(3) 组织脏器:取发病动物肠道组织及肠系膜淋巴结等组织约 1g ,置一 1.5ml 的洁净离心管中,密闭送检。
3. 应避免标本间交叉污染。
4. 标本收集后 可立即检测; 若不 能立即 检测, 可置于 2 ~ 8 ℃冷藏过夜保存;如需长期保存,标本应 冻存于 - 8 0 ℃ 以下,避免反复冻融。
【检验方法】
1. 试剂准备(试剂准备区)
(1)从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂 , 充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
(2)核算当次实验所需要的反应数(n),并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
n =阴性对照数(1T)+阳性对照数(1T)+误差预留量(1T)+样本数
单反液配制表(每份) |
RT-PCR反应液 |
15.0 μL |
逆转录酶 |
2.0 μL |
|
Taq 酶 |
3.0 μL |
( 3 ) 在无菌离心管中加入上述试剂,充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。
2.样本准备(样本处理区)
用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA,具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3.加样
在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本RNA各5 μl、终体积25 μl/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5 μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品,终体积为25 μl/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器上。
4. PCR(PCR扩增区)
(1)取样本处理区准备好的PCR反应管,放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置,并记录放置顺序。
(2)按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。
反应体积 |
25 μL |
通道选择 |
FAM 通道采集 猪流行性腹泻病毒 荧光信号 |
PCR 反应 条件 |
步骤 |
条件 |
循环数 |
反转录 |
42℃:10分钟(min) |
1 |
|
预变性 |
95℃:3分钟(min) |
1 |
|
预扩增 |
95℃:5秒(s) |
5 |
|
55℃:40秒(s) |
|||
PCR扩增 |
95℃:5秒(s) |
40 |
|
55℃:40秒(s) (此阶段结束时采集荧光信号) |
注:ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正,设置淬灭基团选择None。
【参考值(参考范围)】
1.试剂盒有效性判定:
(1)阳性对照:有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。
(2)阴性对照:Ct值>38或无Ct值,线形为直线或轻微斜线,无指数增长期。
2.标本结果判定:
(1) 阳性:标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。
(2)可疑: 标本检测结果Ct值在35~38范围内。此时应对标本进行重复检测,如重复实验结果Ct值仍在35~38范围内,有明显指数增长期,则判定为阳性,否则为阴性。
(3)阴性:标本检测结果Ct值>38或无Ct值。
【检验结果的解释】
通道及检测结果 |
标本检测结果解释 |
FAM |
|
阳性(+) |
标本中检出 猪流行性腹泻病毒RNA |
阴性(-) |
标本中未检出 猪流行性腹泻病毒 RNA |
【检验方法的局限性】
- 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的低检出*可能会发生假阴性的结果。
- 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。
- 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染,则容易得到假阳性结果。
【产品性能指标】 产品的低检出限为10 2 Copies/mL,产品CV值≤5%。
【注意事项】
- 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作,各区实验服、仪器、耗材应独立使用,不能混用;实验用吸头采用带滤芯吸头;样本处理区应配有生物安全柜,样本处理在生物安全柜中进行操作;三个区应该配有紫外线杀菌装置。
- 为避免RNA降解,样本处理过程应在0-4℃条件下操作,且完成实验后立即上机检测;样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。
- 每次实验应该设置阴、阳性对照。
- 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀,并应瞬时离心。
- 试剂盒内所配阴性和阳性对照在 di 一次使用前应全部转移至标本准备区,并单独存放。
- 为防止荧光干扰,应避免裸手直接接触PCR反应管,并应避免在PCR反应管上进行任何标记。
- 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置; 不同批号试剂不能混用。
- ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正,淬灭基因选择None。
- 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。