猪流行性腹泻病毒 PCR 检测试剂盒

【产品名称】

通用名 称： 猪流行性腹泻病毒 PCR 检测试剂盒 （实时荧光PCR法）

英文名称 ： Porcine epidemic diarrhea virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】 2 5 T /盒 & 50 T /盒

【预期用途】

本试剂盒利用实时荧光 PCR 原理，定性检测猪流行性腹泻病毒，对猪流行性腹泻病毒引起的疾病诊断及疗效评估有重要指导意义。

【检验原理】

本试剂盒针对 猪流行性腹泻病毒 的高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含 猪流行性腹泻病毒 基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。

【主要组成成份】

序号	组成	25 T /盒	50 T /盒
1	PEDV  RT-PCR反应液	375 μL×1管	750 μL×1管
2	PEDV 逆转录酶	50 μL×1管	100 μL×1管
3	PEDV  Taq酶	75 μL×1管	150 μL×1管
4	PEDV 阳性对照	40 μL×1管	40 μL×1管
5	PEDV 阴性对照	40 μL×1管	40 μL×1管
6	说明书	1份	1份

注：阴性对照为 猪 基因组DNA，阳性对照为失去活性的 猪流行性腹泻病毒 cDN A 。

【储存条件及有效期】 避光-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期 12 个月。

【适用仪器】 ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。

【样本要求】

1. 适用标本类型：发病动物血液、空肠及小肠肠内容物及组织脏器 ( 肠道组织、肠系膜及淋巴结等 ) 和病毒培养液。

2. 标本采集，方法如下：

(1) 血清：用一次性注射器取静脉血 2-3ml ，转至 5ml 的干燥管中，密闭送检。

(2) 肠内容物：无菌条件下取肠道内容物约 1g 左右，置入 1ml 含有 1.0ml PBS( 或生理盐水 ) 的 5ml 离心管中，立即送检。

(3) 组织脏器：取发病动物肠道组织及肠系膜淋巴结等组织约 1g ，置一 1.5ml 的洁净离心管中，密闭送检。

3. 应避免标本间交叉污染。

4. 标本收集后 可立即检测； 若不 能立即 检测， 可置于 2 ～ 8 ℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应 冻存于 - 8 0 ℃ 以下，避免反复冻融。

【检验方法】

1. 试剂准备（试剂准备区）

（1）从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂 ， 充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。

（2）核算当次实验所需要的反应数（n），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。

n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+误差预留量（1T）+样本数

单反液配制表(每份)	RT-PCR反应液	15.0 μL
	逆转录酶	2.0 μL
	Taq 酶	3.0 μL

 ( 3 ) 在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。

2.样本准备（样本处理区）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。

3.加样

在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本RNA各5 μl、终体积25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5 μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。

4. PCR（PCR扩增区）

（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。

（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。

反应体积	25 μL	通道选择	FAM 通道采集 猪流行性腹泻病毒 荧光信号
PCR 反应 条件	步骤	条件	循环数
	反转录	42℃：10分钟（min）	1
	预变性	95℃：3分钟（min）	1
	预扩增	95℃：5秒（s）	5
		55℃：40秒（s）
	PCR扩增	95℃：5秒（s）	40
		55℃：40秒（s） （此阶段结束时采集荧光信号）

注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正，设置淬灭基团选择None。

【参考值（参考范围）】

1.试剂盒有效性判定：

（1）阳性对照：有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。

（2）阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。

2.标本结果判定：

（1） 阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。

（2）可疑： 标本检测结果Ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。

（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。

【检验结果的解释】

通道及检测结果	标本检测结果解释
FAM
阳性（＋）	标本中检出 猪流行性腹泻病毒RNA
阴性（－）	标本中未检出 猪流行性腹泻病毒 RNA

【检验方法的局限性】

• 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的低检出*可能会发生假阴性的结果。
• 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。
• 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染，则容易得到假阳性结果。

【产品性能指标】 产品的低检出限为10 ²  Copies/mL，产品CV值≤5%。

【注意事项】

• 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作，各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。
• 为避免RNA降解，样本处理过程应在0-4℃条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。
• 每次实验应该设置阴、阳性对照。
• 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。
• 试剂盒内所配阴性和阳性对照在 di 一次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。
• 为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在PCR反应管上进行任何标记。
• 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置； 不同批号试剂不能混用。
• ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正，淬灭基因选择None。
• 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。