l 本试剂盒用于体外定性检测 血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本 中 人百日咳IgM抗体 （ PT-IgM ）。

l 有效期： 6个月

l 保存条件： 2 -8℃

实验原理

试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ ELISA）。往预先包被人百日咳IgM抗体（PT-IgM）捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、阴性和阳性对照，再加入HRP标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人百日咳IgM抗体（PT-IgM）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），判定阴阳性。

样本处理及要求

1. 血清 ： 将收集于血清分离管的全血标本在室温放置 2 小时或 4 ℃ 过夜，然后 1000 × g 离心 20 分钟，取上清即可，或将上清置于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆 ： 用 EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的 30 分钟内于 2-8 ℃ 1000 × g 离心 15 分钟，取上清即可检测，或将上清置于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 保存，但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆： 用预冷的 PBS (0.01M, pH=7.4) 冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS （一般按 1:9 的重量体积比，比如 1g 的组织样品对应 9mL 的 PBS ，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于 5000 × g 离心 5~10 分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清或其它生物标本： 请 1000 × g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将上清置于 -20 ℃或 -80 ℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

需要而未提供的试剂和器材

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、 2-20uL 、 20-200uL 、 200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

试剂盒组成

注意事项

1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置 。

试剂准备

试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

2 0×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1 ： 20 稀释，即 1 份 20× 洗涤缓冲液加 19 份蒸馏水。

操作步骤

1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4℃ 。

2. 设置 阴性对照 孔 、阳性对照孔 和样本 孔， 阴性、阳性对照孔 各加50μL 对照品， 样本孔 中 加 入 待测样本 5 0μL ， 空白孔不加。

3. 除空白孔外， 对照 孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL ，用封板膜封住反应孔， 37℃ 水浴锅或恒温箱温育 60 min。

4. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液 （ 350 μL ） ，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。

5. 每孔加入底物A、 B 各 50μL ， 37℃ 避光孵育 15min 。

6. 每孔加入终止液50μL， 15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。

实验结果计算

1. 阴性对照 OD 值：小于 0.2 。

2. 阳性对照 OD 值：大于 0.8 。

3 、阳性判断（ Cut-Off 值）：阴性对照 OD 值 +0.25 ，样本 OD 值大于阈值，判定为阳性，反之，为阴性。

4 、重复性：板内变异系数小于 15% 。

5 、储藏： 2-8 ℃避光密封保存。