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精品啪啪一级免费视频 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(微板法)

时间:2023/2/13阅读:277
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 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(微板)

产品货号:BA1823

 

产品规格:100T

 

产品简介:

谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione PeroxidaseGSH-Px)是一种含硒的水溶性四聚体蛋白酶。几平在所有组织中都有分布在一些病理状况下谷胱甘肽过氧化物酶的活力会发生明显的变化,该酶可以清除活细胞内过氧化物,在保护细胞免受自由基损伤过程中起着关键作用。细胞内的脂类容易和自由基发生反应,产生脂类过氧化物。谷胱甘肽过氧化物酶不仅具有消除自由基和衍生物的作用,还与过氧化氢酶(CAT)、磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶(PH-GSH-Px)、谷胱甘肽S转移酶(GST)构成不同基质特异性的多水平的还原有机氢过氧化物系统,减少脂质过氧化物的形成,增强机体抗氧化损伤能力。

谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(Glutathione Peroxidase AssayKit)是一种以过氧化氢为底物通过微板法检测细胞、组织或其它样品中谷胱甘肽过氧化物酶活性的试剂盒。绝大部分细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶都是含硒的,且硒为该酶的活性中性组成部分。细胞内也有栖少量的不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶存在。本试剂盒检测的是最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶,该检测法的缺点谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)催化过氧化氢以及许多有机过氧化物,产生水或有机醇,在特殊情况下会影响检测准确性。硒是GSH-Px的必须组成部分,每分子该酶含有含有四分子硒,该酶的活性中心是硒半胱氨酸,测定该酶的活力可以衡量有机体硒水平。其检测原理是GSH-Px可催化谷胱甘肽(GSH)与苯甲酸显色液发生氧化反应,使之生成黄色阴离子,通过酶标仪检测422nm处吸光度值测定该阴离子的浓度,间接推算GSH减少的量。本试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。

 

产品组成:

产品名称

100T

保存条件

试剂(A): 样品匀浆液

50ml

室温

试剂(B): GSH

15.4mg

-20℃,避光

试剂(C): GSH 配制液

10ml

2-8

试剂(D): 氧化剂

2×1ml

室温

试剂(E): 酸性沉淀液

50ml

室温

试剂(F): GSH-Px assay buffer

15ml

室温

试剂(G): 苯甲酸显色液

3ml

-20℃,避光

试剂(H): ddH2O

50ml

室温

 

自备材料:

1. 生理盐水或PBS

2. 离心管、1.5mlEP管或96孔板

3. 酶标仪

4. 水浴锅或恒温箱

5. 离心机 

 

 操作步骤(仅供参考):

1. 样本处理:

a.血清、血浆样本从待测样本中分出的血清或血浆不应有溶血,如果含有应去除红细胞后检测,如超过检测范围,用生理盐水稀释后检测血清去除红细胞的简易方法如下:

用抗凝管收集血液,颠倒混匀。取至少500ul全血,4℃ 3000g离心5min。弃上清,用冷的10倍体积的样品匀浆液重悬红细胞沉淀,再同前离心,弃上清。加入约4倍体积预冷的ddH2O裂解红细胞沉淀, 12000 r/min 离心5min,取上清;亦可采用ACK红细胞裂解液等去除红细胞,取上清。

b.组织样本动物用含有20U/ml heparin的生理盐水(0.9%NaCl containing20U/ml heparin)灌流清除血液后获取组织样品。按照每20mg组织加入200ul样品匀浆液的比例,用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。4℃12000g离心10min。取上清用于酶活性的测定。

c.细胞样本对于贴壁细胞,由于后续用于酶活性的测定,避免使用胰酶消化细胞。可以使用细胞刮或EDTA处理细胞收集细胞。细胞用PBS或生理盐水洗涤1次。按照每106细胞加入300-500ul匀浆液的比例用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆,4℃12000g离心10min,取上清用于酶活性的测定。亦可采用WesternIP细胞裂解液参考相应说明裂解细胞样品,按照每106细胞加入100-200u1裂解液的比例进行裂解,取上清用于酶活性的测定。

d.植物样本:称取0.2g新鲜样品或-80℃冻存的样品,放入预冷的研钵中,加入2ml 预冷的磷酸缓冲液(0.05MpH7.0),在冰浴上研磨或匀浆,转入离心管,4℃ 12000r/min 离心10~15min,取上清,用于酶活性的测定。

2. GSH工作液的配制0.5ml ddH20加入15.4mgGSH中,充分溶解开混匀,即获得GSH储存液(100mmol/L),立即分装后-20℃保存。取适量的GSH储存液(100mmol/L),按GSH配制液GSH储存液(100mmol/L)=99:1的比例稀释至1mmol/L,即为GSH工作液(1mmol/L),该溶液配制好以后可4℃保存1天。

3. 氧化工作液的配制准确取氧化剂0.1ml加入6.5ml ddH20,即为氧化储存液(100×)4℃保存。临用前,准确取氧化储存液(100×)0.1ml加入6.5ml ddH2O,即为氧化储存液 (100×)4℃保存,临用前准确取氧化储存液(100×)0.1ml 加入 9.9ml ddH2O,即为氧化工作液;4℃保存,1天有效。

4. GSH-Px酶促反应可参考下表设置检测反应体系,依次加入试剂

加入物质

空白对照管

光照对照管

测定管

GSH工作液(1mmol/L

-

0.02ml

0.02ml

待测样品

-

-

0.02ml

ddH2O

0.02ml

0.02ml

-

混匀,置于37℃水浴5min

氧化工作液(提前37℃预温)

-

0.01ml

0.01ml

混匀,置于37℃水浴5min

酸性沉淀剂

0.08ml

0.2ml

0.2ml

3500g离心10min

取上清液

-

0.1ml

0.1ml

5. GSH-Px显色反应:可参考下表设置检测反应体系,依次加入试剂:

加入物质

空白对照管

本底对照管

额定管

取上清液

-

0.1ml

0.1ml

空白对照

0.1ml

-

-

GSH-Px Assay Buffer

0.125ml

0.125ml

0.125ml

苯甲酸显色液

0.025ml

0.025ml

0.025ml

6. GSH-Px测定:混匀,置于室温孵育1min,以ddH2O调零,用酶标仪检测422nm处吸光度(即为A空白、A本底、A测定);如果用酶标仪96孔板每孔应加250μl;如果用分光光度计,比色杯光径应为1cm,加入的量应根据比色杯的最小量程而定;经测定,一般情况下A空白在0.003~0.05之间,A本底在0.1~0.3左右。

 

计算:

谷胱甘肽过氧化物酶酶活力单位的定义:排除非酶促反应,在37℃,每1L血清,1min内可以催化1μmol GSH 氧化所需(减少)的酶量为一个GSH-Px活性单位。

GSH-Px(U/L)=(A本底-A测定)/(A本底-A空白)×200

式中:A空白=空白对照的吸光度

A本底=本底对照的吸光度

A测定=待测样品的吸光度

200=1000(ml)/5(min)

注:a[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力的单位为U/L=mU/ml

b、样品(如组织样本)中谷胱甘肽过氧化物酶活力=[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力]×稀释倍数/样品中的蛋白浓度]

[样品中(如组织样本)谷胱甘肽过氧化物酶活力]的单位为:U/mgmU/mg蛋白样品中的蛋白浓度1的单位为:mg/ml

c、计算示例:样品的蛋白浓度经测定为05mg/ml,稀释2倍后进行测定。一般情况下,A空白在0.003~0.05之间,A本底在0.10~0.3左右。如果A本底=0.30A测定=0.20A空白=0.003 那么:

液体样本 GSP-Px活力=(0.30-0.2)/(0.30-0.003)×200×2=134.7U/L

组织样本 GSP-Px活力=134.7U/L×2/(0.5mg/ml)=538.8mU/mg(蛋白)

 

参考区间:成年人血清GSP-Px115~140 U /L

 

注意事项:

1. 上述低温试剂避免反复冻融,以免失效或效率下降。

2. 本法中所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定,如果在样品中的还原剂无法避免,例如DTT、巯基乙醇等,则这些还原剂的总浓度至少低于0.1mM0.15mMDTT可以抑制 40%的酶活力。

3. 常用的 Triton X-100Tween 20等去垢剂都含有较高水平的过氧化物,会影响本试剂盒的测定,如果必须使用这些去垢剂,最好使用纯度较高并注明含较低浓度过氧化物的去垢剂。

4. 样品取出后最好立即测定,也可以-80℃冻存待以后测定。

5. 一定要严格控制反应时的温度,否则会引起较多误差。

 

有效期:12个月有效。

 

 

 


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