谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(微板法)
产品货号:BA1823
产品规格:100T
产品简介:
谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-Px)是一种含硒的水溶性四聚体蛋白酶。几平在所有组织中都有分布,在一些病理状况下谷胱甘肽过氧化物酶的活力会发生明显的变化,该酶可以清除活细胞内过氧化物,在保护细胞免受自由基损伤过程中起着关键作用。细胞内的脂类容易和自由基发生反应,产生脂类过氧化物。谷胱甘肽过氧化物酶不仅具有消除自由基和衍生物的作用,还与过氧化氢酶(CAT)、磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶(PH-GSH-Px)、谷胱甘肽S转移酶(GST)构成不同基质特异性的多水平的还原有机氢过氧化物系统,减少脂质过氧化物的形成,增强机体抗氧化损伤能力。
谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(Glutathione Peroxidase AssayKit)是一种以过氧化氢为底物,通过微板法检测细胞、组织或其它样品中谷胱甘肽过氧化物酶活性的试剂盒。绝大部分细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶都是含硒的,且硒为该酶的活性中性组成部分。细胞内也有栖少量的不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶存在。本试剂盒检测的是最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶,该检测法的缺点谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)催化过氧化氢以及许多有机过氧化物,产生水或有机醇,在特殊情况下会影响检测准确性。硒是GSH-Px的必须组成部分,每分子该酶含有含有四分子硒,该酶的活性中心是硒半胱氨酸,测定该酶的活力可以衡量有机体硒水平。其检测原理是:GSH-Px可催化谷胱甘肽(GSH)与苯甲酸显色液发生氧化反应,使之生成黄色阴离子,通过酶标仪检测422nm处吸光度值测定该阴离子的浓度,间接推算GSH减少的量。本试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。
产品组成:
产品名称 | 100T | 保存条件 |
试剂(A): 样品匀浆液 | 50ml | 室温 |
试剂(B): GSH | 15.4mg | -20℃,避光 |
试剂(C): GSH 配制液 | 10ml | 2-8℃ |
试剂(D): 氧化剂 | 2×1ml | 室温 |
试剂(E): 酸性沉淀液 | 50ml | 室温 |
试剂(F): GSH-Px assay buffer | 15ml | 室温 |
试剂(G): 苯甲酸显色液 | 3ml | -20℃,避光 |
试剂(H): ddH2O | 50ml | 室温 |
自备材料:
1. 生理盐水或PBS
2. 离心管、1.5mlEP管或96孔板
3. 酶标仪
4. 水浴锅或恒温箱
5. 离心机
操作步骤(仅供参考):
1. 样本处理:
a.血清、血浆样本:从待测样本中分离出的血清或血浆不应有溶血,如果含有,应去除红细胞后检测,如超过检测范围,用生理盐水稀释后检测。血清去除红细胞的简易方法如下:
用抗凝管收集血液,颠倒混匀。取至少500ul全血,4℃ 3000g离心5min。弃上清,用预冷的10倍体积的样品匀浆液重悬红细胞沉淀,再同前离心,弃上清。加入约4倍体积预冷的ddH2O裂解红细胞沉淀, 12000 r/min 离心5min,取上清;亦可采用ACK红细胞裂解液等去除红细胞,取上清。
b.组织样本:动物用含有20U/ml heparin的生理盐水(0.9%NaCl containing20U/ml heparin)灌流清除血液后获取组织样品。按照每20mg组织加入200ul样品匀浆液的比例,用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。4℃,12000g离心10min。取上清用于酶活性的测定。
c.细胞样本:对于贴壁细胞,由于后续用于酶活性的测定,避免使用胰酶消化细胞。可以使用细胞刮或EDTA处理细胞收集细胞。细胞用PBS或生理盐水洗涤1次。按照每106细胞加入300-500ul匀浆液的比例用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆,4℃12000g离心10min,取上清用于酶活性的测定。亦可采用Western及IP细胞裂解液参考相应说明裂解细胞样品,按照每106细胞加入100-200u1裂解液的比例进行裂解,取上清用于酶活性的测定。
d.植物样本:称取0.2g新鲜样品或-80℃冻存的样品,放入预冷的研钵中,加入2ml 预冷的磷酸缓冲液(0.05M,pH7.0),在冰浴上研磨或匀浆,转入离心管,4℃ 12000r/min 离心10~15min,取上清,用于酶活性的测定。
2. GSH工作液的配制:取0.5ml ddH20加入15.4mgGSH中,充分溶解开混匀,即获得GSH储存液(100mmol/L),立即分装后-20℃保存。取适量的GSH储存液(100mmol/L),按GSH配制液:GSH储存液(100mmol/L)=99:1的比例稀释至1mmol/L,即为GSH工作液(1mmol/L),该溶液配制好以后可4℃保存1天。
3. 氧化工作液的配制:准确取氧化剂0.1ml加入6.5ml ddH20,即为氧化储存液(100×),4℃保存。临用前,准确取氧化储存液(100×)0.1ml加入6.5ml ddH2O,即为氧化储存液 (100×),4℃保存,临用前准确取氧化储存液(100×)0.1ml 加入 9.9ml ddH2O,即为氧化工作液;4℃保存,1天有效。
4. GSH-Px酶促反应:可参考下表设置检测反应体系,依次加入试剂:
加入物质 | 空白对照管 | 光照对照管 | 测定管 |
GSH工作液(1mmol/L) | - | 0.02ml | 0.02ml |
待测样品 | - | - | 0.02ml |
ddH2O | 0.02ml | 0.02ml | - |
混匀,置于37℃水浴5min | |||
氧化工作液(提前37℃预温) | - | 0.01ml | 0.01ml |
混匀,置于37℃水浴5min | |||
酸性沉淀剂 | 0.08ml | 0.2ml | 0.2ml |
3500g离心10min | |||
取上清液 | - | 0.1ml | 0.1ml |
5. GSH-Px显色反应:可参考下表设置检测反应体系,依次加入试剂:
加入物质 | 空白对照管 | 本底对照管 | 额定管 |
取上清液 | - | 0.1ml | 0.1ml |
空白对照 | 0.1ml | - | - |
GSH-Px Assay Buffer | 0.125ml | 0.125ml | 0.125ml |
苯甲酸显色液 | 0.025ml | 0.025ml | 0.025ml |
6. GSH-Px测定:混匀,置于室温孵育1min,以ddH2O调零,用酶标仪检测422nm处吸光度(即为A空白、A本底、A测定);如果用酶标仪96孔板每孔应加250μl;如果用分光光度计,比色杯光径应为1cm,加入的量应根据比色杯的最小量程而定;经测定,一般情况下A空白在0.003~0.05之间,A本底在0.1~0.3左右。
计算:
谷胱甘肽过氧化物酶酶活力单位的定义:排除非酶促反应,在37℃,每1L血清,1min内可以催化1μmol GSH 氧化所需(减少)的酶量为一个GSH-Px活性单位。
GSH-Px(U/L)=(A本底-A测定)/(A本底-A空白)×200
式中:A空白=空白对照的吸光度
A本底=本底对照的吸光度
A测定=待测样品的吸光度
200=1000(ml)/5(min)
注:a、[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力的单位为U/L=mU/ml。
b、样品(如组织样本)中谷胱甘肽过氧化物酶活力=[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力]×稀释倍数/样品中的蛋白浓度]
[样品中(如组织样本)谷胱甘肽过氧化物酶活力]的单位为:U/mg或mU/mg蛋白样品中的蛋白浓度1的单位为:mg/ml。
c、计算示例:样品的蛋白浓度经测定为05mg/ml,稀释2倍后进行测定。一般情况下,A空白在0.003~0.05之间,A本底在0.10~0.3左右。如果A本底=0.30,A测定=0.20,A空白=0.003 那么:
液体样本 GSP-Px活力=(0.30-0.2)/(0.30-0.003)×200×2=134.7U/L
组织样本 GSP-Px活力=134.7U/L×2/(0.5mg/ml)=538.8mU/mg(蛋白)
参考区间:成年人血清GSP-Px:115~140 U /L
注意事项:
1. 上述低温试剂避免反复冻融,以免失效或效率下降。
2. 本法中所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定,如果在样品中的还原剂无法避免,例如DTT、巯基乙醇等,则这些还原剂的总浓度至少低于0.1mM;0.15mM的DTT可以抑制 40%的酶活力。
3. 常用的 Triton X-100、Tween 20等去垢剂都含有较高水平的过氧化物,会影响本试剂盒的测定,如果必须使用这些去垢剂,最好使用纯度较高并注明含较低浓度过氧化物的去垢剂。
4. 样品取出后最好立即测定,也可以-80℃冻存待以后测定。
5. 一定要严格控制反应时的温度,否则会引起较多误差。
有效期:12个月有效。
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