精品网站在线免费观看 蛋白质相互作用质谱分析是研究蛋白质间相互作用网络的重要技术，广泛应用于疾病机制、信号通路解析和药物靶点发现等领域。以下是其核心内容和关键步骤的整理：
1. 基本原理
目标：通过质谱技术鉴定与目标蛋白（bait protein）直接或间接结合的蛋白质。
策略：结合生化富集（如免疫共沉淀、亲和纯化）和高灵敏度质谱分析。
2. 实验流程
(1) 样品制备
蛋白复合体富集：
免疫共沉淀（Co-IP）：利用抗体捕获目标蛋白及其互作蛋白。
亲和纯化（AP-MS）：使用标签（如Flag、HA）纯化重组蛋白复合物。
交联技术（Crosslinking）：稳定瞬时或弱相互作用（如甲醛交联）。
裂解条件优化：使用温和裂解缓冲液避免复合体解离，添加蛋白酶抑制剂。
(2) 质谱分析
液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）：
酶解：用胰蛋白酶消化蛋白质为肽段。
分离：通过液相色谱分离肽段。
检测：高分辨率质谱（如Orbitrap、Q-TOF）分析肽段序列。
定量方法：
标记定量：TMT、SILAC（标记不同样本的蛋白质）。
无标记定量（Label-free）：基于肽段信号强度比较。
(3) 数据分析
数据库搜索：
工具：MaxQuant、Proteome Discoverer、Mascot。
数据库：UniProt、Swiss-Prot。
互作蛋白筛选：
排除污染物（如角蛋白）和常见非特异性结合蛋白。
对比阴性对照组（如空载体或无关抗体样本）。
生物信息学分析：
功能注释：GO、KEGG分析互作蛋白的生物学功能。
网络构建：使用Cytoscape可视化互作网络。
验证工具：STRING数据库预测互作可靠性。
3. 关键挑战与解决方案
假阳性/假阴性：
严格对照：设置多个阴性对照（如IgG对照、敲除目标蛋白的细胞）。
统计学过滤：基于显著性（p-value）和丰度倍数变化筛选。
弱/瞬时相互作用：
使用交联剂（如DSS）稳定复合物。
提高质谱灵敏度（如DIA模式）。
数据复杂性：
机器学习辅助筛选（如SAINT、CRAPome数据库去污染）。
4. 应用场景
疾病机制：发现癌症中异常互作的蛋白（如EGFR信号网络）。
药物靶点：鉴定药物（如激酶抑制剂）结合的蛋白复合物。
结构生物学：结合冷冻电镜解析复合体结构。
5. 前沿技术
交联质谱（CX-MS）：直接鉴定互作位点。
邻近标记技术（如BioID、TurboID）：在活细胞中标记邻近蛋白，提高空间特异性。
单细胞质谱：研究细胞异质性中的蛋白互作。
6. 注意事项
实验设计：至少3次生物学重复以提高可信度。
样本处理：避免反复冻融和过度离心。
数据分析：多软件交叉验证结果（如同时使用MaxQuant和PD）。
如果需要进一步探讨具体实验方案或数据分析工具，可以提出更详细的问题！
