图 1. FBP1 和 P53 在人类 HCC 中表达下调。

在 83 例 HCC 中，71% 的病例中 FBP1 表达下调，并且与 ALDOB 丢失、AKT 激活、MDM2 Ser166 (AKT 位点) 磷酸化升高以及 p53、p21^CIP1 和 p16^INK4a 表达下降显著相关 (图 1a)。在 HCC 中，FBP1 广泛下调 (图 1b)。低 FBP1 和 ALDOB 表达与较差的生存率相关 (图 1c)。甲基化组分析显示，与正常肝细胞核相比，HCC 细胞核中 FBP1 启动子区域的高甲基化水平，而 TP53 启动子的甲基化未见改变 (图 1d)。TP53 缺失降低了小鼠肝脏、致癌物诱导的 HCC、人类肝细胞以及 TP53 野生型 HCC 细胞系 HepG2 和 SK-Hep-1 中 FBP1 的 mRNA 和蛋白水平 (图 1e)。

图 2. DNA 损伤诱导的 FBP1 和 p53 在 MASH 中的上调。

喂食易感 MASH 的 MUP-uPA 小鼠高果糖饮食 (HFrD)，而非等热量的玉米淀粉饮食 (CSD)，诱导了 p53、p21^CIP1、p16^INK4a 和 FBP1 的表达，并抑制了 AKT 激活 (图 2a)。肝细胞 DNA 损伤及其 DNA 损伤反应 (DDR) 介质升高，同时观察到 P-RPA2 和衰老相关的 β-半乳糖苷酶表达升高 (图 2b)。HFrD 饲喂诱导了早期癌前病变，这些病变中聚泛素化蛋白聚集体和自噬伴侣蛋白 p62 的积累提示自噬受损，NRF2 (NQO1)、CD44 和 MYC 被激活，而 p53 和 FBP1 表达下调 (图 2c)。晚期人类 MASH 蛋白质组和组织的分析证实了 FBP1、ALDOB、p53、p21^CIP1、p16^INK4a 和 DDR 的上调，以及 AKT 和 NRF2 活性的降低 (图 2d)。FBP1 的缺失增加了 HcPC 的数量，而 HcPC 比未聚集的肝细胞表现出更多的 DNA 损伤，同时伴随着 DDR 和 DNMT1 的上调、AKT 和 NRF2 的激活，以及 FBP1、p53、p21^CIP1 和 p16^INK4a 的下调 (图 2e)。单核 RNA 测序表明 FBP1 缺失增加了疾病相关肝细胞的数量，同时减少了 3 区肝细胞 (图 2f)。WB 结果表明 FBP1 缺失缓解了 HFrD 诱导的 AKT 抑制，增强了 GSK3β Ser9 和 MDM2 Ser166 的磷酸化、DDR 标志物的表达，并下调了 p53 和 p21^CIP1 (图 2g)。

图 3. FBP1 或 p53 缺失以及 AKT 激活促进 NRAS^G12V 肿瘤发生。

NRAS^G12V 在 Fbp1^F/F 小鼠中几乎不具肿瘤形成能力，但在 Fbp1^ΔHep 小鼠中，它迅速诱导轻度纤维化的 HCC，这些肿瘤阳性表达 α-胎蛋白 (AFP)、CD44 和 MYC (图 3a, b)。与 NRF2 激活一致，p53 和 p21 表达下调 (图 3c)。肝细胞 Trp53 缺失同样支持了快速的 NRAS^G12V 诱导的 HCC，同时下调 FBP1 并增强 AKT 和 NRF2 的激活 (图 3d)。在 Fbp1^F/F 和 Fbp1^ΔHep 小鼠肝脏中转导了 AAV8-Ctrl、AAV8-FBP1 和 AAV8-FBP1(E98A)，两者均显著减少了肿瘤数量和体积 (图 3e)。AKT 抑制剂 (AKTi) 和 nutlin-3a 也阻止了 NRAS^G12V 诱导的 HCC，nutlin-3a 不影响 AKT 或 NRF2，而 AKTi 阻断了 NRF2 的激活、AKT 和 GSK3β 的磷酸化以及 MDM2 的磷酸化，同时恢复了 p53 和 p21^CIP1 的表达 (图 3f–h)。

图 4. NRF2 诱导的 FBP1 降解缓解衰老以激发肿瘤形成。

HCC 细胞中 FBP1 缺失激活了 NRF2 (图 4a)。在 Nrf2^Act-Hep 小鼠中特异性表达 NRF2 (E79Q) 会下调 FBP1 和 p53 (图 4b)。ATG7 缺失通过 p62 积累激活 NRF2 并增强 HCC 发展，这导致了更为显著的 FBP1 下调 (图 4c)。HCC 细胞中表达 NRF2 (E79Q) 加速了 FBP1 的周转 (图 4d)，FBP1 有两个潜在的 ERK 磷酸化受体，包括 Ser271，其中用丙氨酸替换可阻止 ERK 诱导的磷酸化及其与 FBP1 相关的泛素连接酶 TRIM28 的招募 (图 4e)。ERK2 沉默可阻止 TRIM28 诱导的 FBP1 泛素化，而磷酸模拟突变 S271D 则增强了这一过程 (图 4f)。FBP1 低表达的人类 HCC 还显示出 NRF2、NQO1 和 ERK 磷酸化的上调 (图 4g)。

图 5. NRF2 和 FBP1 逆向影响肝细胞转录组。

Nrf2^Act-Hep 与 Nrf2^Tg/Tg、Fbp1^ΔHep 与 Fbp1^F/F 肝脏重叠上调基因的基因本体生物学过程 (GO BP) 富集分析结果 (图 5a)。Nrf2^Act-Hep 与 Nrf2^Tg/Tg 和 Fbp1^ΔHep 与 Fbp1^F/F 肝脏重叠下调基因的基因本体生物学过程富集分析 (图 5b)。对照或 NRAS^G12V 流体动力学尾静脉注射 (HTVI) 1 周后 Nrf2^Tg/Tg 和 Nrf2^Act-Hep 肝脏细胞衰老 mRNA 的热图数据 (图 5c，d)。CPTAC-LIHC 数据中 FBP1 蛋白的细胞衰老 (CS) (上) 和细胞周期 (下) 评分。(图 5e)。

图 6. 突变特征和 HCC 从 DNA 损伤和衰老前驱细胞中出现的过程。

基于 hfrd 诱导的 MUP-uPA Fbp1^ΔHep HCC 的三核苷酸的突变频率特征 (图 6a)。NRAS^G12V 诱导的 Nrf2^Act-Hep HCC 的突变频率特征 (图 6b)。冷冻 mT/mG 肝脏切片 DAPI 染色结果 (图 6c)。