生牛乳中富含多种天然活性蛋白，如 α-乳白蛋白 (α-Lactalbumin)、β-乳球蛋白 (β-Lactoglobulin)、乳铁蛋白(Lactoferrin, LF)、免疫球蛋白 G (Immunoglobulin G, IgG) 和乳过氧化物酶 (Lactoperoxidase, LP) 等，这些天然活性蛋白在抵抗细菌、病毒入侵，增强免疫力，促进组织修复和生长发育等方面发挥着重要作用。其中 α-乳白蛋白具有抗癌、抗菌和抗病毒作用，调节免疫功能，促进乳糖合成和乳分泌；β-乳球蛋白具有降胆固醇、抗氧化和抗病毒活性，促进脂溶性维生素的消化吸收。不同的热处理方式（巴氏杀菌、超高温 (UHT) 灭菌、蒸发浓缩及喷雾干燥等），会导致乳制品中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白出现不同程度的变性失活，从而影响其营养价值及市场售价。
赛默飞新行标应对方案亮点
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NY/T 4630-2025
赛默飞完整应用解决方案
样品前处理
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仪器配置及色谱条件
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谱图及数据
3.1 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液的分离谱图及数据
图 1 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液的分离谱图及数据 (100 μg/mL)（点击查看大图）
如图 1 所示，α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白色谱峰形良好，柱效优异，分离度优于标准。α-乳白蛋白保留时间为 21.900 min，不对称因子 0.98，理论塔板数 321137；β-乳球蛋白 B 保留时间为 24.747 min，不对称因子 1.01，理论塔板数 352451；β-乳球蛋白 A 保留时间为 25.467 min，不对称因子 1.00，理论塔板数 373359。α-乳白蛋白与 β-乳球蛋白 B 分离度为 17.77，β-乳球蛋白 B 与 β-乳球蛋白 A 分离度为 4.33。
3.2 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白单一标准品溶液定位叠加谱图
图 2 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白单一标准品溶液定位叠加谱图（点击查看大图）
α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白单标定位色谱图及光谱图，如图 2 所示，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白 B 和 β-乳球蛋白 A 均在 200 nm 和 279 nm 处有特征吸收。
3.3 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液连续进样叠加谱图
图 3 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液连续进样叠加谱图 (100 μg/mL, n=4)（点击查看大图）
α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液 (100 μg/mL) 连续四次进样，保留时间和峰面积的 RSD 均小于 0.3%，方法重现性好，分离谱图及数据详见图 3。
3.4 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白标准品溶液校准曲线叠加谱图
图 4 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白标准品溶液校准曲线叠加谱图 (0.00/40.0/80.0/120/160/200 μg/mL)（点击查看大图）
生牛乳、巴氏杀菌乳中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的含量通常都较高，因而选取了 T/TDSTIA 002-2021 和 T/TDSTIA 007-2019 两个团体标准推荐的线性范围。如图 4 所示，α-乳白蛋白标准品溶液线性范围 0.00-200 μg/mL，线性相关系数 r2≥0.9997，β-乳球蛋白标准品溶液线性范围 0.00-200 μg/mL，线性相关系数 r2≥0.9991，线性良好。其中 β-乳球蛋白 B 和 β-乳球蛋白 A 采用化合物组进行定量。
3.5 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白标准品溶液 (40.0 μg/mL) 与空白溶液叠加谱图
图 5 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白标准品溶液 (40.0 μg/mL) 与空白溶液叠加谱图（点击查看大图）
当进样体积为 10 uL 时，以 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白 (40.0 μg/mL) 的峰高为 S，选取 22.5-24.0 min 基质噪音的平均值为 N，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白 B 和 β-乳球蛋白 A 的信噪比 S/N 分别为 523.3、139.9 和 133.6，如图 5 所示。因此，配合进样体积的优化，α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白测定方法灵敏度亦可满足 NY/T 4630-2025 中 1.00 μg/mL 的要求。
3.6 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液与巴氏杀菌乳样品溶液叠加谱图
图 6 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液与巴氏杀菌乳样品溶液叠加谱图（点击查看大图）
除乳清蛋白外，牛乳中还含有大量的酪蛋白和其他蛋白，可能会对 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的测定产生干扰。巴氏杀菌乳样品经调节 pH 、高速离心等前处理操作后，未变性的 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白保留在上清液中，其分离保留的峰型较好、基线平稳且出峰时无干扰，如图 6 所示。采用外标法定量，巴氏杀菌乳样品中 α-乳白蛋白为 1033.6 mg/kg和 β-乳球蛋白含量为 2949.0 mg/kg，基本与标签值相符。
3.7 巴氏杀菌乳（低温奶）、超高温灭菌乳（常温奶）及婴幼儿配方奶粉样品溶液分离谱图及数据
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α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白对温度较敏感，高温会破坏其化学结构及生物活性。如图 7-9 所示，巴氏杀菌乳（低温奶）中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白目标峰附近均不存在明显干扰峰，可准确定性和定量，生牛乳、巴氏杀菌乳等样品适用于 NY/T 4630-2025 第一法；而超高温灭菌乳（常温奶）和婴幼儿配方奶粉中 β-乳球蛋白目标峰附近存在明显干扰峰，会严重影响定性和定量结果，α-乳白蛋白受影响相对较小，超高温灭菌乳、婴幼儿配方奶粉等样品不适用于 NY/T 4630-2025 第一法，建议采用第二法。
3.8 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白标准溶液凝胶渗透色谱图（第二法）
图 10 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白标准溶液 (500 mg/L) 凝胶渗透色谱图（点击查看大图）
参考杜茹芸老师在《中国乳品工业》期刊发表的文章《体积排阻色谱法测定牛奶、乳粉、乳清粉中 α-乳白蛋白的含量》（2022 年），串联使用两支 MAbPac SEC-1 (300 Å, 5 μm, 7.8×300 mm) 体积排阻色谱柱，以 6 M 盐酸胍为流动相进行等度洗脱，在 280 nm 下可有效分离 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白（如图 10 所示），并测试了 60 个批次的牛奶、奶粉及乳清粉，以验证方法适用性和稳定性，相关谱图及数据详见原文。
文中选用 MAbPac SEC-1 色谱柱规格为 7.8×300 mm，推荐流速为 0.5 mL/min，在确保分离度的前提下实现溶剂节省，可选用 4.0×300 mm 规格色谱柱，建议流速为 0.2 mL/min （可酌情适当调整）。
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参考文献
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