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鸟an酸转氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)试剂盒说明书

时间:2025/1/9阅读:496
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鸟氨酸转氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)试剂盒说明书

微量法 100T/96S

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义:

脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同,分为谷氨酸( Glu) 和鸟氨酸( Orn) 两条合成途径。鸟氨酸转氨酶( δ-OAT) 是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶,对植物适应逆境胁迫起关键作用。

测定原理:

鸟氨酸和α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和 NADH 作用下发生氨基转移反应生成吡咯啉-5-羧酸(P5C),同时产生NAD,通过检测 340nm 处的吸光度的变化可反映鸟氨酸转氨酶活性的高低。

组成:

 

产品名称

BH6016-100T/96S

Storage

提取液:液体

110ml

4

试剂一:液体

30ml

4

试剂二:粉剂

1 

4

试剂三:粉剂

1 

4

试剂四:粉剂

2 

-20

说明书

1

 

试剂二临用前加 8ml 试剂一充分溶解;用不完的试剂 4℃保存。试剂三临用前加 8ml 试剂一充分溶解;用不完的试剂 4℃保存。试剂四临用前每瓶加 4ml 试剂一充分溶解;现配现用。

自备仪器和用品:

天平、低温离心机、研钵、酶标仪、96 孔板。

酶液提取:

1、组织:按照质量(g):提取液体积(ml) 15~10 的比例(建议称取约 0.1g,加入 1ml 提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,10000g 离心 10min,取上清置冰上待测。

2、细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(ml 500~10001 的比例(建议 500 万细胞加入1ml 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min;然后 4℃,10000g离心 10min,取上清置冰上待测。 3、液体:直接检测。

测定操作:

1、酶标仪预热 30min,调节波长至 340nm

2、将配好的试剂二、三、四 37℃预热 5min。(注意:粉剂试剂需要自行配制

3、取 96 孔板,依次加入 60μl 试剂二,60μl 试剂三,60μl 试剂四,20μl 粗酶液,充分混匀,记录 340nm

处初始吸光值和 37℃反应 10min 的吸光值A2A=A1-A2

计算公式:

96 孔板测定的计算公式如下

(1) 按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 δ-OATnmol/min /mg prot=ΔA÷(ε×d×V 反总÷(V ×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

(2) 按照样本质量计算

酶活单位定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 δ-OATnmol/min /g 鲜重)=ΔA÷(ε×d×V 反总÷(W ×V ÷V 样总) ÷T

=321.54×ΔA÷W

(3) 按照细胞数量计算

酶活单位定义:每 104 个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 δ-OATnmol/min /104 cell= ΔA÷(ε×d×V 反总÷(V ×细胞数量÷V 样总) ÷T

=321.54×ΔA÷细胞数量

(4) 按照液体体积计算

酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 δ-OATnmol/min /ml)=ΔA÷(ε×d×V 反总÷V ÷T

=321.54×ΔA

V 反总:反应体系总体积,0.2mlε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd96 孔板光径, 0.5cmV 样:加入样本体积,0.02mlV 样总:加入提取液体积,1mlT:反应时间,10 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mlW:样本质量,g


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