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杭州实了个验生物科技有限公司
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荧光定量pcr罗氏480使用流程
2025-6-10 阅读(48)
荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于基因表达分析、病原体检测和基因分型的技术。罗氏LightCycler® 480是一款常用的荧光定量PCR仪，具有高灵敏度和稳定性。以下为详细操作步骤，供参考使用。
一、实验前准备
仪器检查
确认LightCycler® 480主机、电脑及软件处于正常工作状态。
检查加热盖是否清洁，避免污染或残留物影响实验结果。
确保电源连接稳定，避免实验过程中断电。
耗材与试剂准备
DNA模板或cDNA
引物和探针（如TaqMan探针或SYBR Green染料）
聚合酶（如Taq DNA聚合酶）
dNTPs
缓冲液
使用兼容的PCR反应板或毛细管（如96孔板或384孔板）。
准备荧光定量PCR试剂，包括：
若使用探针法，需确认探针与仪器检测通道匹配（如FAM、HEX等）。
环境准备
实验区域需清洁，避免气溶胶污染。
建议在超净台或通风橱中配制反应体系，减少外源DNA污染风险。
二、反应体系配制
计算反应体积
根据样本数量和实验设计，计算所需试剂总量（通常单反应体积为10-20 μL）。
预留额外10%体积以补偿移液误差。
配制主混合液（Master Mix）
将除模板外的所有试剂（缓冲液、dNTPs、引物、探针、聚合酶等）混合，涡旋振荡后短暂离心。
分装至PCR板或毛细管中，避免产生气泡。
加入模板
在单独区域加入DNA或cDNA模板，避免交叉污染。
每孔模板体积需保持一致（如2-5 μL）。
设置阴性对照（无模板对照，NTC）和阳性对照。
密封反应板
使用光学密封膜覆盖反应板，确保密封性。
若使用毛细管，需检查是否闭合。
三、程序设置与运行
启动软件
打开LightCycler® 480软件，选择“New Experiment"创建新实验。
设置实验名称、保存路径及用户信息。
编辑程序
95℃ 10秒 → 65℃ 60秒 → 95℃连续升温（0.1℃/秒）并采集荧光。
变性：95℃ 10-30秒
退火：50-60℃ 10-30秒（根据引物Tm值调整）
延伸：72℃ 10-30秒（视产物长度而定）
预变性阶段：95℃维持3-10分钟，激活聚合酶。
扩增循环（通常35-45个循环）：
荧光采集：在退火或延伸阶段采集信号（根据染料类型选择单色或多色检测）。
熔解曲线分析（仅SYBR Green法）：
板布局设置
在软件中定义样本位置，标注对照孔和待测样本孔。
选择荧光通道（如FAM对应通道1，HEX对应通道2）。
运行程序
将反应板放入仪器，确认放置平稳。
点击“Start"开始运行，实时监测扩增曲线。
四、数据分析
基线调整
软件自动或手动设置基线范围（通常为前3-15个循环）。
确保扩增曲线在阈值线（Threshold）附近呈现清晰的指数增长。
阈值设定
手动调整阈值线至指数增长期上方，软件自动计算Ct值（循环阈值）。
结果解读
定量分析：通过标准曲线计算模板浓度（绝对定量）或比较ΔΔCt值（相对定量）。
熔解曲线：SYBR Green法需检查单峰（特异性扩增）或多峰（引物二聚体或污染）。
排除异常值（如NTC出现扩增提示污染）。
导出数据
保存实验文件，导出Ct值、熔解曲线等数据。
生成报告（PDF或Excel格式）。
五、实验后处理
仪器维护
关闭软件和主机电源，清洁反应槽及加热盖。
定期进行校准（如光学校准或温度校准）。
耗材处理
废弃反应板按生物危害废物处理。
毛细管需妥善丢弃，避免划伤。
数据备份
将实验结果备份至云端或外部存储设备。
六、常见问题与解决方案
无扩增信号
检查试剂活性（如聚合酶是否失活）。
确认引物探针设计正确，模板质量合格。
非特异性扩增
优化退火温度或更换引物。
增加模板稀释度减少抑制物影响。
重复性差
检查移液精度，确保反应体系均一。
避免模板降解或污染。
注意事项
分区操作：模板添加与主混合液配制需在不同区域进行。
避免频繁打开反应板，防止气溶胶污染。
定期验证仪器性能，确保数据可靠性。
以上为罗氏LightCycler® 480荧光定量PCR的标准操作流程，具体参数需根据实验目的优化。
