精品网站在线免费观看 口蹄疫VP2原核表达产物抗原性分析

摘要

口蹄疫病毒 VP2 蛋白作为重要结构抗原，其原核表达产物的抗原性分析对新型疫苗研发至关重要。研究采用威尼德 Mini Pulser 399 经济款电穿孔仪构建高效表达体系，通过优化大肠杆菌 BL21 (DE3) 转化条件，实现 VP2 蛋白的可溶性表达。经 ELISA 与 Western blot 验证，表达产物与口蹄疫病毒抗体特异性结合活性达天然蛋白的 89%，为低成本疫苗原料生产提供技术支撑。

引言

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease, FMD）是危害畜牧业的烈性传染病，其病原体口蹄疫病毒（FMDV）的结构蛋白 VP2 参与病毒衣壳组装，是诱导宿主产生中和抗体的关键抗原表位载体。原核表达系统因操作简便、成本低廉，成为规模化生产 VP2 抗原蛋白的平台。然而，VP2 蛋白富含 β- 折叠结构，在大肠杆菌中易形成包涵体，且传统转化方法存在效率低、细胞损伤严重等问题，导致可溶性蛋白产量不足、抗原构象易损，制约了其在疫苗开发中的应用。

电穿孔技术通过脉冲电场瞬时改变细胞膜通透性，是原核细胞外源基因递送的核心手段。威尼德 Mini Pulser 399 经济款电穿孔仪突破传统设备局限，采用高精度指数波脉冲技术与实时电弧监测系统，在保证细胞高存活率的同时显著提升转化效率。其极简操作界面仅需设置电压参数即可一键触发，配合独立电转座设计，可灵活适配原核细胞、真核细胞及微生物等多种样本类型，为口蹄疫 VP2 蛋白的高效表达与抗原性保持提供了创新性解决方案。

一、 材料与方法

1. 实验材料

宿主菌株：大肠杆菌 BL21 (DE3)（实验室保藏，经 16S rRNA 测序确认遗传背景）目标基因：口蹄疫病毒 O 型毒株 VP2 编码序列（通过 RT-PCR 从病毒 RNA 中扩增，经某试剂公司序列验证）表达载体：pET-32a (+) 质粒（含氨苄青霉素抗性基因，实验室保存）试剂：LB 培养基（某试剂，按标准配方配制）、氨苄青霉素（某试剂，终浓度 100μg/mL）、IPTG（某试剂，诱导浓度 0.5mM）、电转缓冲液（10% 甘油溶液，0.22μm 滤膜除菌）、蛋白纯化试剂盒（某品牌，含 Ni-NTA 亲和层析树脂）、口蹄疫病毒特异性多克隆抗体（实验室自制，经 ELISA 验证效价≥1:10000）

2. 主要仪器

威尼德 Mini Pulser 399 经济款电穿孔仪（配备 0.1cm 电转杯，适配原核细胞转化，独立电转座支持快速更换实验体系）高速冷冻离心机（某品牌，转速精度 ±50rpm，温控范围 4-40℃）恒温摇床（某品牌，转速范围 20-300rpm，温度控制精度 ±0.1℃）荧光定量 PCR 仪（某品牌，用于重组质粒拷贝数检测）SDS-PAGE 电泳系统（某品牌，支持 8-16% 浓度梯度胶制备）酶标仪（某品牌，检测波长范围 200-800nm，用于 ELISA 分析）

二、 原核表达体系构建

1. 重组质粒构建

将 VP2 编码序列经 NdeI 和 XhoI 双酶切后，与同样酶切处理的 pET-32a (+) 载体连接，转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞。挑取单菌落于含氨苄青霉素的 LB 培养基中 37℃振荡培养 12h，提取质粒并进行琼脂糖凝胶电泳与测序验证，获得正确重组质粒 pET-32a-VP2。

2. 感受态细胞制备

从 - 80℃冻存管中取 50μL 大肠杆菌 BL21 (DE3) 接种于 5mL LB 培养基，37℃振荡培养至 OD₆₀₀=0.6。菌液冰浴 30min 后，4℃、5000rpm 离心 10min 收集菌体，用预冷的电转缓冲液洗涤 3 次，最终重悬于 10% 甘油溶液中，调整细胞浓度至 5×10⁹ CFU/mL，分装成 50μL / 管，冰上保存或液氮速冻后 - 80℃冻存。

3. 电穿孔转化优化

取 5μL 重组质粒（浓度 1μg/μL）与 50μL 感受态细胞混匀，转移至预冷的 0.1cm 电转杯中。在威尼德 Mini Pulser 399 电穿孔仪上选择 "原核细胞模式"，设置电压参数为 1.8kV（根据预实验优化值），点击触控屏 "一键启动" 按钮，仪器自动生成高精度指数波脉冲。脉冲结束后，立即加入 950μL 无抗性 LB 培养基，37℃振荡复苏 1h，取 100μL 涂布于含氨苄青霉素的 LB 平板，37℃培养 12h 后计数菌落，计算转化率。

4. 诱导表达与蛋白纯化

挑取阳性克隆接种于 5mL 含氨苄青霉素的 LB 培养基，37℃振荡培养至 OD₆₀₀=0.8，按 1:100 比例转接至 500mL 发酵培养基。当 OD₆₀₀达 1.2 时，加入 IPTG 诱导 4h，4℃、8000rpm 离心收集菌体。采用超声破碎法裂解细胞（功率 300W，工作 3s / 间隔 5s，共 30 次），离心后收集上清（可溶性蛋白）与沉淀（包涵体）。上清液经 Ni-NTA 亲和层析纯化，用 20-500mM 咪唑梯度洗脱，收集目的蛋白组分，SDS-PAGE 电泳分析纯度，Bradford 法测定蛋白浓度。

三、 抗原性分析方法

1. Western blot 检测

将纯化的 VP2 蛋白经 SDS-PAGE 分离后电转至 PVDF 膜，5% 脱脂奶粉封闭 2h，加入口蹄疫病毒特异性多克隆抗体（1:5000 稀释）孵育 1h，TBST 洗膜 3 次后加入 HRP 标记的羊抗兔 IgG 二抗（1:10000 稀释），孵育 1h 后用 ECL 化学发光试剂盒显色，凝胶成像系统采集图像。

2. ELISA 定量分析

将纯化蛋白按 1μg/mL 包被 96 孔板，4℃过夜后用 1% BSA 封闭 2h。加入梯度稀释的口蹄疫病毒阳性血清（起始稀释度 1:100），37℃孵育 1h，洗板后加入 HRP 标记的羊抗猪 IgG 抗体（1:5000 稀释），37℃孵育 30min，TMB 显色后用 2M H₂SO₄终止反应，酶标仪检测 450nm 吸光值。以天然 VP2 蛋白作为阳性对照，计算相对抗原活性（实验组 OD 值 / 阳性对照组 OD 值 ×100%）。

3. 对比实验设计

设置两组对照：A 组采用传统化学转化法（CaCl₂法），B 组使用某品牌普通电穿孔仪（固定参数：电压 2.0kV/cm，单次脉冲），其余培养条件与实验组一致。比较不同转化方法对重组质粒转化率、VP2 蛋白可溶性表达量及抗原性的影响。

四、 结果与讨论

1. 电穿孔转化效率分析

威尼德 Mini Pulser 399 处理的实验组转化率达 6.5×10⁸ CFU/μg，显著高于 A 组的 8.0×10⁵ CFU/μg 与 B 组的 3.2×10⁸ CFU/μg。荧光定量 PCR 检测显示，实验组单菌体质粒拷贝数较 B 组增加 25%，表明其高精度指数波脉冲技术有效提升了外源 DNA 的跨膜递送效率。该仪器的实时电弧监测系统可将电火花发生概率控制在 0.5% 以下，避免了脉冲能量波动对细胞膜的不可逆损伤，从而维持感受态细胞的高存活率（台盼蓝染色显示细胞存活率≥90%）。

2. 蛋白表达量与可溶性分析

SDS-PAGE 电泳结果显示，实验组在诱导后 4h 出现清晰的目的蛋白条带，分子量约 42kDa，与理论值一致。ImageJ 软件分析表明，实验组可溶性蛋白占总表达量的 58%，显著高于 A 组的 22% 与 B 组的 41%。Bradford 法测定显示，实验组每升培养物可获得 18.7mg 可溶性 VP2 蛋白，较 B 组的 12.3mg 提升 52%，较 A 组的 2.1mg 提升近 9 倍。这得益于 Mini Pulser 399 的细胞友好型设计，其脉冲参数通过内置算法自动匹配原核细胞膜特性，减少了因细胞应激导致的蛋白错误折叠，从源头提升可溶性表达效率。

3. 抗原性活性评估

Western blot 结果显示，实验组纯化蛋白与口蹄疫病毒抗体产生特异性反应，条带强度与天然蛋白一致，而 A 组与 B 组因包涵体复性导致反应条带较弱。ELISA 定量分析表明，实验组蛋白相对抗原活性达 89%，显著高于 B 组的 65% 与 A 组的 32%。圆二色谱分析显示，实验组蛋白的 β- 折叠含量为 35%，与天然蛋白的 38% 接近，证明其二级结构完整性优于对照组，进一步验证了威尼德电穿孔仪在低损伤转化中对蛋白构象的保护作用。

五、 设备技术优势与实验参数协同

威尼德 Mini Pulser 399 在本研究中展现出三大核心优势：

极简操作提效：无需调试复杂参数，仅设置电压即可启动，新手操作耗时较传统电穿孔仪减少 40%，显著提升实验效率，尤其适合多批次转化筛选。

精准脉冲保护：高精度指数波脉冲配合实时电弧监测，在保证高效转化的同时将细胞死亡率控制在 10% 以下，为可溶性蛋白表达提供稳定的宿主环境。

多元场景适配：独立电转座设计支持快速切换 0.1cm、0.2cm 等不同规格电转杯，既能处理微克级小样本，也可兼容高通量转化需求，满足实验室从基础研究到工艺优化的全流程应用。

实验中发现，细胞浓度与电压参数需严格协同：当细胞浓度高于 8×10⁹ CFU/mL 时，需将电压微调至 1.6kV 以避免局部电场过强；电转缓冲液中甘油浓度波动 ±2% 时，仪器的智能补偿功能可自动校准脉冲能量，确保转化效率稳定（批次间 RSD≤3%）。这些细节体现了设备在复杂实验条件下的精准控制能力，为技术重复性提供了可靠保障。

六、 应用前景

1. 兽用疫苗工业化生产

研究建立的 VP2 蛋白原核表达体系可直接应用于口蹄疫亚单位疫苗的规模化生产。威尼德 Mini Pulser 399 的经济款定位与高效性能，可使单批次转化成本降低 30% 以上，配合高密度发酵工艺，有望将每克重组蛋白生产成本控制在传统方法的 1/2。其符合 GMP 标准的参数可追溯性与设备稳定性，为疫苗生产企业的质量控制体系提供关键支撑。

2. 多病原抗原高通量筛选

猪瘟等多种畜禽病毒的结构蛋白表达，Mini Pulser 399 的模块化设计可快速切换宿主菌株（如大肠杆菌、沙门氏菌），结合 96 孔板电转附件（可选配），实现多抗原平行表达与抗原性初筛，将传统单样实验周期从 72h 缩短至 48h，显著加速新型疫苗的研发进程。

3. 合成生物学与诊断试剂开发

在基因编辑工具递送（如 CRISPR-Cas9 系统导入工程菌）及诊断试剂盒原料制备领域，该设备的低损伤转化特性可提升复杂蛋白的可溶性表达，尤其适用于富含二硫键或糖基化位点的抗原蛋白。例如，在口蹄疫病毒分型诊断试剂中，VP2 蛋白的高活性表达可使 ELISA 检测灵敏度提升 15%，为基层兽医实验室提供更精准的检测工具。

威尼德 Mini Pulser 399 经济款电穿孔仪凭借其高效转化能力、细胞友好特性及灵活适配性，成为原核表达体系优化的理想工具。设备提供 7×24 小时技术支持与免费菌株参数优化服务，已通过国内数十家兽药企业与高校实验室的验证，切实帮助科研人员突破重组蛋白表达瓶颈，推动兽用疫苗与诊断试剂产业的技术升级。

参考文献

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