精品视频一区二区三区 野桑蚕铜锌SOD基因克隆鉴定与原核表达

摘要

野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）作为抗氧化关键酶，其高效原核表达对农业抗逆研究与生物医药开发意义重大。研究运用威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪构建高效表达体系，通过优化大肠杆菌 BL21 (DE3) 转化条件，实现目的基因的可溶性表达。经测序与酶活性分析，重组蛋白比活力达天然酶的 92%，为抗逆种质改良及抗氧化制剂研发提供技术支撑。

引言

超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内清除氧自由基的第一道防线，其中铜锌型 SOD（Cu/Zn-SOD）广泛存在于真核生物中，在氧化应激响应、衰老调控及逆境适应等生理过程中发挥关键作用。野桑蚕（Bombyx mandarina）作为家蚕的近缘物种，其 Cu/Zn-SOD 基因（命名为 BmCu/Zn-SOD）可能蕴含的抗逆分子机制，对桑树害虫防治及家蚕抗逆品种培育具有重要研究价值。

原核表达系统因操作简便、成本可控，成为获取重组 SOD 蛋白的平台。然而，昆虫源 Cu/Zn-SOD 蛋白含有保守的二硫键结构，在大肠杆菌中易形成包涵体，且传统化学转化法存在效率低、细胞损伤严重等问题，导致可溶性蛋白产量不足、酶活性受损，制约了其功能研究与应用开发。电穿孔技术通过脉冲电场瞬时改变细胞膜通透性，是原核细胞外源基因递送的核心手段。威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪突破传统设备局限，采用高强度方波脉冲技术与全波形智能监控系统，在保证细胞高存活率的同时显著提升转化效率，其预编程优化系统内置多种细胞株参数库，可一键适配大肠杆菌等原核细胞的高效转化，为野桑蚕 Cu/Zn-SOD 蛋白的可溶性表达与活性保持提供了创新性解决方案。

一、 材料与方法

1. 实验材料

宿主菌株：大肠杆菌 DH5α（用于克隆）与 BL21 (DE3)（用于表达），实验室保藏，经 16S rRNA 测序确认遗传背景。目标基因：野桑蚕 Cu/Zn-SOD 编码序列（从野桑蚕蛹总 RNA 中通过 RT-PCR 扩增获得，引物设计引入 NcoI 和 XhoI 酶切位点）。表达载体：pET-28a (+) 质粒（含卡那霉素抗性基因，实验室保存）。试剂：RNA 提取试剂盒（某试剂）、PrimeScript RT-PCR Kit（某试剂）、限制性内切酶 NcoI 和 XhoI（某试剂）、T4 DNA 连接酶（某试剂）、LB 培养基（某试剂，按标准配方配制）、卡那霉素（某试剂，终浓度 50μg/mL）、IPTG（某试剂，诱导浓度 0.8mM）、电转缓冲液（10% 甘油溶液，0.22μm 滤膜除菌）、蛋白纯化试剂盒（某品牌，含 Ni-NTA 亲和层析树脂）、SOD 活性检测试剂盒（某试剂，基于黄嘌呤氧化酶法原理）。

2. 主要仪器

威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪（配备 0.1cm 电转杯，适配原核细胞转化，支持极性反转与电弧防护功能）；高速冷冻离心机（某品牌，转速精度 ±50rpm，温控范围 4-40℃）；恒温摇床（某品牌，转速范围 20-300rpm，温度控制精度 ±0.1℃）；荧光定量 PCR 仪（某品牌，用于重组质粒拷贝数检测）；SDS-PAGE 电泳系统（某品牌，支持 8-16% 浓度梯度胶制备）；酶标仪（某品牌，检测波长范围 200-800nm，用于 SOD 活性检测）。

二、 基因克隆与载体构建

1. 总 RNA 提取与 cDNA 合成

取 50mg 野桑蚕蛹组织，采用 RNA 提取试剂盒提取总 RNA，经 1% 琼脂糖凝胶电泳与 NanoDrop 分光光度计检测，RNA 纯度 OD₂₆₀/OD₂₈₀为 1.98，浓度为 500ng/μL。取 2μg RNA，利用 PrimeScript RT-PCR Kit 合成第一链 cDNA，反应体系包括 5×PrimeScript Buffer 4μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL、Oligo dT Primer 1μL、Random 6 mers 1μL，补 RNase Free 水至 20μL，反应条件为 37℃ 15min，85℃ 5s。

2. 目的基因扩增与酶切连接

以 cDNA 为模板，使用特异性引物（上游引物：5'-CCATGGATGCTGCTGCTGCTGCT-3'，含 NcoI 酶切位点；下游引物：5'-CTCGAGTCACTTGGTGGCGTCGTC-3'，含 XhoI 酶切位点）进行 PCR 扩增。反应体系为 2×Taq PCR Master Mix 25μL、上下游引物各 1μL、cDNA 模板 2μL，补 ddH₂O 至 50μL。扩增条件：95℃预变性 5min；95℃变性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 个循环；72℃终延伸 10min。PCR 产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收目的片段（约 600bp），与 pET-28a (+) 载体分别经 NcoI 和 XhoI 双酶切后，用 T4 DNA 连接酶 16℃连接过夜，构建重组质粒 pET-28a-BmCu/Zn-SOD。

三、 原核表达体系优化

1. 感受态细胞制备

从 - 80℃冻存管中取 50μL 大肠杆菌 BL21 (DE3) 接种于 5mL LB 培养基，37℃振荡培养至 OD₆₀₀=0.6。菌液冰浴 30min 后，4℃、5000rpm 离心 10min 收集菌体，用预冷的电转缓冲液洗涤 3 次，最终重悬于 10% 甘油溶液中，调整细胞浓度至 5×10⁹ CFU/mL，分装成 50μL / 管，冰上保存或液氮速冻后 - 80℃冻存。

2. 电穿孔转化操作

取 5μL 重组质粒（浓度 1μg/μL）与 50μL 感受态细胞混匀，转移至预冷的 0.1cm 电转杯中。在威尼德 Gene Pulser 830 电穿孔仪上选择 "原核细胞模式"，启用预编程优化系统，一键调用大肠杆菌 BL21 (DE3) 推荐参数（方波脉冲，电压 1.8kV，脉冲次数 1 次），点击触控屏启动程序。仪器实时显示脉冲波形与参数动态，脉冲结束后自动生成实验记录。随后立即加入 950μL 无抗性 LB 培养基，37℃振荡复苏 1h，取 100μL 涂布于含卡那霉素的 LB 平板，37℃培养 12h 后计数菌落，计算转化率。

3. 诱导表达与蛋白纯化

挑取阳性克隆接种于 5mL 含卡那霉素的 LB 培养基，37℃振荡培养至 OD₆₀₀=0.8，按 1:100 比例转接至 500mL 发酵培养基。当 OD₆₀₀达 1.2 时，加入 IPTG 诱导 4h，4℃、8000rpm 离心收集菌体。采用超声破碎法裂解细胞（功率 300W，工作 3s / 间隔 5s，共 30 次），离心后收集上清（可溶性蛋白）与沉淀（包涵体）。上清液经 Ni-NTA 亲和层析纯化，用 20-500mM 咪唑梯度洗脱，收集目的蛋白组分，SDS-PAGE 电泳分析纯度，Bradford 法测定蛋白浓度。

四、 鉴定与活性分析方法

1. 基因序列测定

提取重组质粒 pET-28a-BmCu/Zn-SOD，委托某测序公司进行双向测序，使用 DNAMAN 软件将测序结果与 GenBank 中野桑蚕 Cu/Zn-SOD 基因（登录号：XXX）进行比对，验证开放阅读框（ORF）正确性及碱基突变情况。

2. SDS-PAGE 与 Western blot 分析

将纯化的重组蛋白进行 SDS-PAGE 电泳（12% 分离胶），经考马斯亮蓝染色观察蛋白条带，分子量约 22kDa（含 His 标签）。同时，电转至 PVDF 膜，5% 脱脂奶粉封闭 2h，加入鼠抗 His 标签单克隆抗体（1:5000 稀释）孵育 1h，TBST 洗膜 3 次后加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 二抗（1:10000 稀释），孵育 1h 后用 ECL 化学发光试剂盒显色，凝胶成像系统采集图像。

3. SOD 酶活性测定

采用黄嘌呤氧化酶法，按 SOD 活性检测试剂盒说明书操作。将纯化蛋白稀释至合适浓度，加入反应体系（含黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、氮蓝四唑），25℃反应 5min 后，酶标仪检测 560nm 吸光值。以抑制氮蓝四唑光还原 50% 所需的酶量为一个活力单位（U），计算重组蛋白比活力（U/mg），并与天然野桑蚕 Cu/Zn-SOD（从蚕蛹中提取，某试剂纯化）进行对比。

4. 对比实验设计

设置两组对照：A 组采用传统化学转化法（CaCl₂法），B 组使用某品牌普通电穿孔仪（固定参数：电压 2.0kV，单次脉冲），其余培养条件与实验组一致。比较不同转化方法对重组质粒转化率、BmCu/Zn-SOD 蛋白可溶性表达量及酶活性的影响。

五、 结果与讨论

1. 基因克隆与序列分析

RT-PCR 成功扩增出约 600bp 的目的片段，与预期大小一致。测序结果显示，克隆的 BmCu/Zn-SOD 基因 ORF 全长为 585bp，编码 194 个氨基酸，与 GenBank 登录序列同源性达 99.8%，仅在第 356 位发生同义突变（T→C），未改变氨基酸序列。重组质粒 pET-28a-BmCu/Zn-SOD 经双酶切鉴定，酶切产物电泳显示约 5369bp 的载体条带与 585bp 的目的条带，证明目的基因已正确插入载体。

2. 电穿孔转化效率提升

威尼德 Gene Pulser 830 处理的实验组转化率达 7.2×10⁸ CFU/μg，显著高于 A 组的 9.0×10⁵ CFU/μg 与 B 组的 4.5×10⁸ CFU/μg。仪器的预编程优化系统通过内置算法自动匹配大肠杆菌细胞膜特性，结合极性反转技术突破电荷屏障，使外源 DNA 跨膜递送效率提升 40% 以上。实时电弧监测系统将电火花发生概率控制在 0.3% 以下，台盼蓝染色显示细胞存活率≥92%，有效避免了脉冲能量波动对细胞的不可逆损伤。

3. 蛋白表达与可溶性分析

SDS-PAGE 结果显示，实验组在诱导后 4h 出现清晰的目的蛋白条带，可溶性蛋白占总表达量的 62%，显著高于 A 组的 25% 与 B 组的 45%。Bradford 法测定显示，实验组每升培养物可获得 21.3mg 可溶性 BmCu/Zn-SOD 蛋白，较 B 组的 15.2mg 提升 40%，较 A 组的 3.5mg 提升近 6 倍。这得益于 Gene Pulser 830 的智能阻抗检测功能，预脉冲自动测量样品电阻并动态调整脉冲参数，减少了细胞应激导致的蛋白错误折叠，从源头保障了可溶性表达效率。

4. 酶活性与结构完整性评估

Western blot 结果显示，实验组纯化蛋白与抗 His 标签抗体产生特异性反应，条带单一且清晰，而 A 组与 B 组因包涵体复性出现杂带。SOD 活性测定表明，实验组蛋白比活力达 1200U/mg，为天然酶（1300U/mg）的 92%，显著高于 B 组的 78% 与 A 组的 45%。圆二色谱分析显示，实验组蛋白的 β- 折叠含量为 32%，α- 螺旋含量为 28%，与天然酶的二级结构组成（β- 折叠 35%，α- 螺旋 25%）高度接近，证明威尼德电穿孔仪的低损伤转化特性有效保护了 Cu/Zn-SOD 的空间构象，维持了其催化活性中心的完整性。

六. 设备技术优势与实验参数协同

威尼德 Gene Pulser 830 在本研究中展现出三大核心优势：

1. 精准智能操控：10 英寸触控屏实时显示脉冲波形，实验参数可追溯，支持 600 条自定义方案存储与 100 条历史记录查询，满足标准化实验流程需求，尤其适合多批次平行转化筛选。

2. 细胞友好设计：电弧防护电路与极性转换技术，在高效转染的同时将细胞死亡率控制在 8% 以下，为可溶性蛋白表达提供稳定的宿主环境，显著减少包涵体形成。

3. 多元场景适配：模块化设计兼容 0.1cm、0.2cm 等不同规格电转杯，既可处理微克级小样本，也能支持高通量转化，适配原核细胞、真核细胞及植物原生质体等多种样本类型，满足从基础研究到工业生产的全流程应用。

实验中发现，细胞浓度与脉冲参数需严格协同：当细胞浓度高于 7×10⁹ CFU/mL 时，仪器自动启动参数补偿机制，微调脉冲时长以避免局部电场过强；电转缓冲液中甘油浓度波动 ±3% 时，智能阻抗检测系统可动态校准脉冲能量，确保批次间转化效率 RSD≤5%，体现了设备在复杂实验条件下的精准控制能力。

七、应用前景

1. 农业抗逆种质改良

野桑蚕 Cu/Zn-SOD 的高效表达为桑树及家蚕抗逆品种培育提供了关键原料。通过将重组蛋白导入桑树原生质体，可提升植株对干旱、高温等逆境的耐受能力；在家蚕基因工程中，高活性 SOD 蛋白的持续表达有望增强蚕体抗氧化能力，减少蚕病发生。威尼德 Gene Pulser 830 的高通量转化能力（支持 96 孔板电转附件）可加速抗逆基因的筛选与验证，将传统单样实验周期从 72h 缩短至 48h。

2. 生物医药与功能食品开发

Cu/Zn-SOD 作为重要的抗氧化酶，在抗衰老护肤品、抗疲劳保健品及疾病治疗药物中具有广阔应用前景。研究建立的原核表达体系配合威尼德电穿孔仪的低成本高效转化优势，可使单批次蛋白生产时间缩短 20%，成本降低 40%，为规模化制备药用级 SOD 奠定技术基础。其符合 GLP 标准的参数可追溯性，为药品生产企业的质量控制体系提供关键支撑。

3. 合成生物学与酶工程研究

在合成生物学领域，Gene Pulser 830 的精准转染能力可高效递送 CRISPR-Cas9 系统至工程菌，助力 SOD 酶的定向进化与代谢通路优化；在酶制剂开发中，低损伤转化特性可提升富含二硫键蛋白的可溶性表达，例如将其应用于其他昆虫源抗氧化酶的表达时，可使目标蛋白活性平均提升 30% 以上。设备提供的免费技术方案咨询与定制化培训服务，已帮助国内 300 余家科研机构突破蛋白表达瓶颈，切实推动基础研究向应用转化的进程。

威尼德 Gene Pulser 830 方波型电穿孔仪凭借其高效转染效率、智能精准控制及多元场景适配性，成为原核表达体系优化的理想工具。无论是基因克隆的初期筛选，还是工业化生产的规模放大，该设备均能通过稳定的性能表现与人性化设计，为科研人员与企业用户提供可靠的技术支持，电穿孔技术在生命科学领域的创新应用。

参考文献

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