低密度脂蛋白脂质代谢研究关键工具“荧光标记脂蛋白”详解-赛默飞

低密度脂蛋白脂质代谢研究关键工具“荧光标记脂蛋白”详解

由于脂质代谢在各种疾病中的重要作用，它是药物发现的关键目标。通过调节脂质合成、储存和分解，靶向脂质代谢可以帮助管理肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化等代谢性疾病。它还可以通过抑制肿瘤生长和克服药物耐药性用于癌症治疗。此外，靶向脂质代谢通路提供了治疗神经退行性疾病、心血管疾病和炎症性疾病的潜在方法。

今天我们将聚焦脂质代谢研究关键工具“荧光标记脂蛋白”，进行深入解析。

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LDL在脂质代谢药物开发中的重要性

低密度脂蛋白（LDL）是血液中胆固醇的主要载体。它将胆固醇运输到组织，对于细胞膜结构和激素合成至关重要。然而，过多的LDL胆固醇会导致动脉中形成斑块，导致动脉粥样硬化和心血管疾病。因此LDL一直是药物发现的重要目标，比如：

1. 他汀类药物：这些药物抑制HMG-CoA还原酶，这是一种胆固醇合成的关键酶，从而降低LDL-Cholesterol（LDL-C）水平。

2. PCSK9抑制剂：PCSK9是一种降解肝细胞上LDL受体的蛋白质。抑制PCSK9可以增加LDL受体的数量，增强LDL-C从血液中的清除。

3. 依折麦布 (Ezetimibe)：这种药物抑制小肠对胆固醇的吸收，从而降低血液中的LDL-C水平。

正在进行中的研究集中在寻找新的和更有效的方法来管理LDL水平。这包括开发小分子抑制剂、单克隆抗体和基于RNA的治疗方法，这些方法靶向LDL代谢及其调节的各个方面。

01脂蛋白种类（Lipoproteins）

血浆中含有大量的脂类物质，而脂类不溶于水。这些脂类会与载脂蛋白结合，形成可溶性脂蛋白（Lipoproteins）存在于血浆中，随后脂蛋白会随着血液循环到全身各处的细胞参与脂质代谢。脂蛋白的结构通常由三部分组成：表面是由磷脂、游离胆固醇组成的单层膜，单层膜上同时会结合特定载脂蛋白，以及单层膜内包围着一个由非极性脂质（主要是胆固醇酯和甘油三酯）组成的疏水核心（图1）。

图1.脂蛋白结构

脂蛋白的脂类比例、载脂蛋白种类不同，导致其各自理化性质也不尽相同。根据超速离心法，按照脂蛋白颗粒密度大小差异，分为乳糜微粒（Chylomicrons，CM）、极低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein，VLDL）、中间密度脂蛋白（Intermediate density lipoprotein，IDL）、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（High density lipoprotein，HDL），如以下表格所示。

表1. 脂蛋白分类^[1]

02天然脂蛋白

不同脂蛋白，负责不同的代谢功能。内源性脂蛋白途径始于肝脏中VLDL的形成。VLDL中携带的甘油三酯在肌肉和脂肪组织中被脂蛋白脂肪酶代谢，释放游离脂肪酸，形成IDL。IDL进一步代谢为LDL，LDL被许多组织（包括肝脏，其是主要的摄取部位）的LDL受体吸收。胆固醇的逆向转运始于肝脏和肠道形成新生HDL。这些小的HDL颗粒随后可以吸收从细胞中流出的胆固醇和磷脂，最终形成成熟的HDL。成熟的HDL可以从细胞中获取额外的胆固醇。然后，HDL将胆固醇转运至肝脏，直接或间接地将胆固醇转移到VLDL或LDL。^[1]胆固醇从巨噬细胞流出到HDL在预防动脉粥样硬化发展中起着重要作用。

图2. 内源性脂蛋白通路^[1]

LDL也可以被作为细胞或疾病标志物，内皮细胞、巨噬细胞和小胶质细胞等细胞对LDL吞噬能力的改变，往往在心血管和脂质运输研究中作为标志事件。荧光标记的LDL，通常被用于直接检测细胞吞噬水平能力。

03修饰型脂蛋白

LDL在体内存在着不同的修饰，包括氧化的LDL（Oxidized LDL, Ox-LDL）、乙酰化的LDL（Acetylated LDL, Ac-LDL）等。天然LDL被细胞摄取依赖于细胞膜表面的LDL受体（LDLR）。然而，内皮细胞、巨噬细胞和小胶质细胞等摄取Ox-LDL、Ac-LDL等修饰型脂蛋白的过程，则更多依赖于特异性针对这些修饰型脂蛋白的“清道夫”受体。如下图所示，不同细胞类型中，靶向修饰型脂蛋白的“清道夫”受体不尽相同。^[2]因此，研究不同“清道夫”受体的功能，往往需要选择不同类型的修饰型脂蛋白。

图3. 低密度脂蛋白受体分类^[2]

在细胞损伤模型上，Ox-LDL也被用于诱导某些巨噬细胞产生泡沫细胞（foam cell），以研究泡沫细胞与动脉粥样硬化的相关性^[3]。Ac-LDL可用在内皮细胞和小神经胶质细胞的功能研究，也可用作泡沫样细胞生成的阳性对照。

04荧光标记脂蛋白

为了满足多重荧光的示踪标记，我们有不同荧光标记的脂蛋白可以选择。在决定好LDL天然型或者修饰型后，我们还需要选择合适的荧光基团。通过将荧光探针与LDL结合，使其在特定波长下发出荧光信号，从而实现对LDL摄取、转运及代谢过程的实时追踪。如下图所示，研究人员可以使用荧光标记的脂蛋白与细胞共孵育，从而能实现在荧光显微镜下，追踪脂蛋白的摄取及代谢活动过程。ox-LDL进入细胞后，会转移到晚期内体或溶酶体，进一步被降解后释放游离胆固醇。通过给ox-LDL标记荧光，研究人员能实现对细胞中脂蛋白的转运运输能力进行检测。^[4]

图4. 荧光标记oxLDL追踪细胞摄取脂蛋白能力^[4]

LDL探针种类

除了未标记的LDL以外，我们还提供两类标记的LDL探针：一类探针含有未修饰的天然型LDL，用于研究正常胆固醇的递送和内化机制；另一类探针含有Ox-LDL或Ac-LDL，用于研究表达特异性结合该修饰型LDL 的受体的内皮细胞、小胶质细胞和其他细胞类型。在荧光类型上，我们提供Alexa Fluor、DiI、BODIPY FL以及pHrodo这4类荧光标记基团的选择。

荧光基团特性

其中，BODIPY FL容易被488 nm激光谱线激发，且其化学稳定性更高，耐受多元环境，适合流式细胞术和共聚焦激光显微镜观察。DiI是一类亲脂性染料，染料能够容易地进入LDL的疏水部分，确保标记的准确性和稳定性。而Alexa Fluor属于小分子染料，拥有明亮且光稳定的特性，可以适用于多标记实验进行流式细胞仪和共聚焦激光扫描显微镜分析。

在全部荧光标记的LDL相关产品中，有一类特殊的荧光基团pHrodo。这类荧光基团是pH敏感型的探针。这些染料在酸性环境中发出荧光但在中性 pH 值环境下几乎不显示信号。当 pH 环境酸化时，pHrodo 染料的荧光增加与细胞内囊泡酸化相关，这使得这些染料成为研究内吞作用或吞噬作用及其受环境因素、药物或病原体调节的宝贵工具。在后面的推文中，我们也会详细来看，以pHrodo这类染料为代表的，抗体标记类产品在抗体药筛选标记以及吞噬检测中的应用。

参考文献：

1. Feingold, K. R. (2022). Lipid and lipoprotein metabolism. Endocrinology and Metabolism Clinics, 51(3), 437-458.

2. Ashraf, M. Z., & Gupta, N. (2011). Scavenger receptors: implications in atherothrombotic disorders. The international journal of biochemistry & cell biology, 43(5), 697-700.

3. Guo, J., & Du, L. (2024). An update on ox-LDL-inducing vascular smooth muscle cell-derived foam cells in atherosclerosis. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 12, 1481505.

4. Liang K, Dai JY. Progress of potential drugs targeted in lipid metabolism research. Front Pharmacol. 2022 Dec 16;13:1067652. doi: 10.3389/fphar.2022.1067652. PMID: 36588702; PMCID: PMC9800514.

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