磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）试剂盒说明书微量法

磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

磷脂酶A2（EC3.1.1.4）是磷脂sn-2位脂酰基水解酶，广泛存在于动植物组织、细菌、细胞核分泌物中，参与脂肪消化，精子成熟、细胞信号传递、脂质过氧化修复、宿主反应等生理过程，在控制体内磷脂类物质平衡、调节机体新陈代谢、参与疾病的病理进程等方面发挥着及其重要的作用。

测定原理

磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱（HEPC）产生游离巯基，与DTNB反应生成黄色物质，在412nm处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、超速冷冻离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板。

试剂组成和配制

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体×5 瓶，-20℃避光保存。临用前根据用量每瓶加入 1.8mL 试剂二充分混匀。(3天使用完)

样品处理

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g 离心5min，取全部上清于4℃、100000g 离心 30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。

3. 血清：直接测定。

测定操作

计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T

= 73.53×△A÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性（nmol/min/g）= △A÷（ε×d）×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷T

= 73.53×△A÷W

3. 细胞数量计算

酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力

单位。

PLA2 活性（nmol/min/10⁴cell）= △A÷（ε×d）×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T= 73.53×△A÷细胞数量

4 按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T= 73.53×△A

ε：TNB 消光系数，13600L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，1mL；V 样：反应体系中加入样本体积，0.1mL；W：样本质量，g；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T

=147.06×△A÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性（nmol/min/g）= （ε×d）×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷T

= 147.06×△A÷W

3. 细胞数量计算

酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性（nmol/min/10⁴cell）= △A÷（ε×d）×V 反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T=147.06×△A÷细胞数量

4 按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T

= 147.06×△A

ε：TNB 消光系数，13600L/mol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V 反总：反应总体积，1mL；V 样：反应体系中加入样本体积，0.1mL；W：样本质量，g；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min

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