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磷脂酶 A2(phospholipase A2,PLA2)试剂盒说明书微量法

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  • 上传时间

    2024年10月11日
关键词
PLA2试剂盒,微量法试剂盒,磷脂酶 A2试剂盒,试剂盒说明书,phospholipase A2
上传者
上海研谨生物科技有限公司
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资料简介

磷脂酶 A2(phospholipase A2,PLA2)试剂盒说明书

微量法

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

磷脂酶A2(EC3.1.1.4)是磷脂sn-2位脂酰基水解酶,广泛存在于动植物组织、细菌、细胞核分泌物中,参与脂肪消化,精子成熟、细胞信号传递、脂质过氧化修复、宿主反应等生理过程,在控制体内磷脂类物质平衡、调节机体新陈代谢、参与疾病的病理进程等方面发挥着及其重要的作用。

测定原理

磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱(HEPC)产生游离巯基,与DTNB反应生成黄色物质,在412nm处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、超速冷冻离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板。

试剂组成和配制

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 20mL×1 瓶,4℃保存。

试剂三:液体×5 瓶,-20℃避光保存。临用前根据用量每瓶加入 1.8mL 试剂二充分混匀。(3天使用完)

样品处理

1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,10000g 离心5min,取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1mL试剂一。

2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后于4℃,10000g 离心5min,取全部上清于4℃、100000g 离心 30min,弃上清,取沉淀溶于1mL试剂一。

3. 血清:直接测定。

测定操作


对照管

测定管

样品(μL)

20

20

试剂二(μL)

180


试剂三(μL)


180

充分混匀,37℃反应 10min,于微量石英比色皿/96 孔板,蒸馏水调零,测定 412nm 处吸光值,记为 A 对照管和 A 测定管,△A=A 测定管- A 对照管

 

计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性(nmol/min/mg protε×d)×反总÷(样×Cpr)÷T

= 73.53×△A÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:每克组织每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性(nmol/min/gε×d)×反总÷(W×V 样÷样总)÷T

= 73.53×△A÷W

3. 细胞数量计算

酶活性定义:每104个细胞每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力

单位。

PLA2 活性(nmol/min/104cellε×d)×反总÷(样×细胞数量÷样总)÷T= 73.53×△A÷细胞数量

4 按照液体体积计算

酶活性定义:每毫升血清每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性(nmol/min/mLε×d)×反总÷样÷T= 73.53×△A

εTNB 消光系数,13600L/mol/cmd:比色皿光径,1cm反总:反应总体积,1mL;V 样:反应体系中加入样本体积,0.1mL;W:样本质量,g;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性(nmol/min/mg protε×d)×反总÷(样×Cpr)÷T

=147.06×△A÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:每克组织每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性(nmol/min/gε×d)×反总÷(W×V 样÷样总)÷T

= 147.06×△A÷W

3. 细胞数量计算

酶活性定义:每104个细胞每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/104cellε×d)×反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T=147.06×△A÷细胞数量

4 按照液体体积计算

酶活性定义:每毫升血清每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

 

PLA2 活性(nmol/min/mLε×d)×反总÷样÷T

= 147.06×△A

εTNB 消光系数,13600L/mol/cmd:比色皿光径,0.5cm反总:反应总体积,1mL;V 样:反应体系中加入样本体积,0.1mL;W:样本质量,g;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min

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